détection de Pneumocystis jiroveci dans des échantillons respiratoires par quatre méthodes de coloration

Pneumocystis jiroveci, précédemment connu sous le nom de Pneumocystis carinii, reste une cause importante de pneumonie chez les patients immunodéprimés, bien que les infections par cet agent aient diminué après l’utilisation généralisée d’un traitement antirétroviral hautement actif (HAART) pour l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) (9, 12). Les Patients qui sont immunodéprimés pour des raisons autres que L’infection par le VIH sont également à risque de pneumonie causée par P., jiroveci, y compris les patients atteints de tumeurs malignes hématologiques et ceux qui ont reçu des agents immunosuppresseurs pour le traitement des maladies auto-immunes (2, 11, 12).

bien que divers tests d’amplification des acides nucléiques, y compris des tests PCR en temps réel, aient été mis au point pour la détection de P. jiroveci, ces tests ne sont pas courants dans la plupart des laboratoires de microbiologie clinique et ne sont pas disponibles dans le Commerce (3, 5). Par conséquent, la principale méthode de laboratoire pour la détection de P., le jiroveci, un organisme qui ne peut pas être cultivé par des méthodes standard, est l’examen visuel direct de l’échantillon clinique après un certain type de méthode de coloration (12). Une variété de taches histochimiques ont été utilisées pour détecter la Pneumocyste dans des échantillons cliniques. Ces taches histochimiques comprennent les taches Diff-Quik, Grocott-Gomori methenamine silver (GMS) et Calcofluor White. Diff – Quik stain est une modification de Wright stain (3). La tache GMS est une tache de précipitation d’argent couramment utilisée pour visualiser les champignons dans les sections histologiques (10)., La tache blanche de Calcofluor est une tache fluorescente dont l’ingrédient actif est le cellufluor, qui se lie non spécifiquement aux polysaccharides bêta-liés, tels que la chitine et la cellulose, et est utilisé pour la visualisation directe de champignons dans des échantillons cliniques (4). Des taches immunofluorescentes, qui utilisent des anticorps dirigés contre P. jiroveci, sont également disponibles pour la détection directe de cet organisme dans des échantillons cliniques (3, 5). Ces taches sont similaires aux taches immunofluorescentes directes et indirectes utilisées pour la détection de virus dans les échantillons cliniques., Chaque tache a ses partisans; les données comparatives de L’ère HAART sont limitées.

Par conséquent, nous avons effectué une évaluation multi-institutionnelle de quatre méthodes de coloration couramment utilisées pour la détection directe de P. jiroveci dans des échantillons respiratoires cliniques. Les lames des échantillons respiratoires étudiés, dont la majorité étaient des échantillons de lavage broncho-alvéolaire, ont été préparées par cytocentrifugation. Des frottis répétés de 313 échantillons respiratoires soumis à l’examen de P. jiroveci ont été examinés pour détecter la présence de P. jiroveci avec le blanc de Calcofluor (Fungifluor; Polysciences, Inc.,, Warington, Pennsylvanie.), De la GMS, Diff-Quik (Baxter Scientifique, McGraw Parc, Ill.), et Merifluor Pneumocystis (Meridian Bioscience, Inc., Cincinnati, Ohio) taches. Les lames ont été colorées avec les taches Merifluor Pneumocystis et Diff-Quik conformément aux instructions du fabricant. Pour la coloration blanche au Calcofluor, 1 goutte de Fungifluor a été ajoutée à chaque lame, la lamelle a été appliquée de manière à ce que le réactif recouvre toute la zone contenant l’échantillon et la lame a été laissée reposer pendant au moins 10 min dans une chambre d’humidité sombre à température ambiante avant l’interprétation avec un microscope à fluorescence., Pour la coloration GMS, les lames ont été micro-ondées pendant 40 s dans une solution d’acide chromique à 10%, lavées à l’eau, puis nettoyées avec du métabisulfite de sodium à 1% pendant 30 s. Après le lavage des lames à l’eau distillée, elles ont été placées dans un pot de Copline contenant 50,0 ml de solution de travail, Les lames ont été rincées à nouveau avec de l’eau distillée, traitées avec 1% de chlorure d’or pendant 2 à 5 s, rincées avec de l’eau distillée, exposées à 5% de thiosulfate de sodium pendant 1 min, contre-colorées avec une solution de travail vert clair, nettoyées dans du xylène, recouvertes de lamelles de couverture et examinées par microscopie optique de routine.

chacun des laboratoires des quatre établissements participants a effectué l’une des différentes taches et a rendu ses interprétations en fonction de cette méthode de coloration., Les personnes de chaque établissement avaient l’expérience de la méthode de coloration qui y était pratiquée et de l’interprétation de la coloration. Les échantillons ont reçu des codes d’identification uniques et chaque tache a été examinée indépendamment, sans connaître le résultat obtenu par une autre méthode de coloration sur le même échantillon., La quantité de spécimen était rarement insuffisante pour faire les quatre lames; 308 lames étaient disponibles pour la coloration avec du blanc de Calcofluor, 310 lames étaient disponibles pour la coloration avec du Pneumocystis de Merifluor, 307 lames étaient disponibles pour la coloration avec Diff-Quik et 310 lames étaient disponibles pour la coloration avec du GMS. Dans aucun des cas où une diapositive n’était indisponible en raison d’une quantité insuffisante d’échantillon, la catégorisation de cet échantillon comme étant un vrai positif ou un vrai négatif (voir ci-dessous) ne dépendait du résultat de la diapositive absente.,

la sensibilité, la spécificité et les valeurs prédictives positives et négatives ont été calculées par des méthodes standard (Tableau 1). Les proportions de résultats vrai-positifs et faux-positifs pour les tests appariés ont été comparées avec le test du chi-carré à l’aide du logiciel statistique EpiCalc 2000 (www.brixtonhealth.com/epicalc.html).

bien que la coloration Mérifluor Pneumocystis ait décelé plus d’échantillons vrais positifs, ce nombre n’était pas significativement différent de celui décelé par les taches Calcofluor white (P = 0,260) et GMS (P = 0,343)., De même, le nombre de vrais positifs détectés par le GMS et les taches blanches de Calcofluor n’étaient pas significativement différents (P = 0,838) les uns des autres. Cependant, le nombre de vrais positifs détectés par la coloration Diff-Quik était significativement inférieur à ceux détectés par les taches Mérifluor Pneumocystis (P = 0,002), GMS (P = 0,027) et Calcofluor white (P = 0,042). Le nombre de faux positifs n’était pas significativement différent entre les taches blanches de Calcofluor, GMS et Diff-Quik (chaque comparaison avait une valeur P de >0,05)., Cependant, le nombre de faux positifs rapportés après coloration par Mérifluor Pneumocystis était significativement plus élevé que ceux rapportés après coloration par GMS (P = 0,004), Calcofluor white (P = 0,001) ou Diff-Quik (P = 0,001).

Dans certains cas, un échantillon d’expectoration induite peut être le premier échantillon reçu pour l’évaluation de la présence de Pneumocystis dans le bilan diagnostique d’un patient atteint d’une pneumonie suspectée d’être causée par cet organisme (6)., Si un échantillon d’expectoration induit ne parvient pas à produire l’agent étiologique de la pneumonie, un échantillon de lavage broncho-alvéolaire, qui est beaucoup plus coûteux et comporte un faible risque pour le patient, peut être nécessaire pour obtenir du matériel de diagnostic., En raison des différences dans le traitement de la pneumonie causée par la Pneumocyste par rapport à la pneumonie causée par d’autres micro-organismes et de la nécessité éventuelle d’une bronchoscopie, qui entraîne des coûts et des risques supplémentaires pour le patient, dans le cas où un diagnostic n’est pas établi, il est important que la meilleure méthode de coloration possible soit,

de plus, l’importance d’une méthode de coloration sensible et spécifique à l’ère de L’HAART est particulièrement importante, car la prévalence plus faible de la pneumonie causée par la Pneumocyste affecte négativement la valeur prédictive positive de tout test ayant une spécificité inférieure à 100% (9). Bien que la prévalence de la pneumonie causée par Pneumocystis soit différente à l’ère HAART que dans l’ère pré-HAART, le choix de la méthode de coloration optimale pour la détection de Pneumocystis est également important pour les patients présentant d’autres conditions immunodéprimantes qui sont à risque d’infection., En fait, le choix de la méthode de coloration optimale peut être plus important pour la détection de Pneumocystis chez les patients immunodéprimés non infectés par le VIH, car il a été démontré que les échantillons respiratoires de ces patients ont une charge d’organismes plus faible que ceux des patients immunodéprimés infectés par le VIH (6).

d’après notre expérience, la coloration Diff-Quik n’était pas un moyen efficace de dépistage de la présence de P. jiroveci (c’est-à-dire une méthode de coloration primaire) en raison de la faible sensibilité et de la valeur prédictive négative de cette coloration. Beaucoup plus de spécimens contenant du P., les jiroveci ont été manqués par la méthode Diff-Quik par rapport au blanc de Calcofluor, au Pneumocystis de Merifluor et au GMS. Raab et coll. décrivez également une faible sensibilité (68%) et une faible spécificité (88%) lorsque la tache Diff-Quik seule a été utilisée pour la détection de Pneumocystis et d’autres champignons dans des échantillons de lavage broncho-alvéolaire (10). Ces résultats contrastent cependant avec ceux d’autres groupes, qui ont indiqué que la méthode Diff-Quik était comparable à la méthode de coloration GMS pour la détection de Pneumocystis (7, 8)., Un groupe a signalé que la méthode Diff-Quik était plus sensible que le blanc de Calcofluor, la coloration immunofluorescente directe et même la PCR, mais ces résultats n’ont pas été corroborés (1).

à L’inverse, la coloration par Mérifluor Pneumocystis était la méthode de coloration la plus sensible et pourrait s’avérer utile comme écran pour exclure la présence de Pneumocystis, mais c’était la méthode la moins spécifique dans cette étude. Cependant, le nombre de résultats faussement positifs avec la tache de Mérifluor Pneumocystis était significativement plus élevé que celui rapporté pour chacune des autres taches., La tache de Mérifluor Pneumocystis avait une valeur prédictive positive de seulement 81,9%, comparativement aux trois autres méthodes, qui avaient toutes des valeurs prédictives positives supérieures à 96%. Ng et coll. ont également décrit des résultats apparemment faussement positifs avec cette méthode de coloration (8). Par conséquent, nous suggérons que si Merifluor Pneumocystis est utilisé comme méthode de coloration primaire dans un laboratoire de microbiologie clinique, une confirmation avec une deuxième méthode devrait être effectuée pour augmenter la spécificité et la valeur prédictive positive du résultat final du test.,

les sensibilités des taches Calcofluor white et GMS étaient intermédiaires entre celles des taches Diff-Quik et Merifluor Pneumocystis, mais elles étaient très spécifiques et présentaient des valeurs prédictives positives supérieures à 96% et des valeurs prédictives négatives supérieures à 93%. Fraire et coll. ont également décrit les taches de blanc de Calcofluor et de GMS comme comparables pour la détection de Pneumocystis, avec une concordance de 92,6% (4). Baughman et coll., (1a) décrivent également la sensibilité d’une tache d’anticorps immunofluorescent indirect qui est dirigée vers Pneumocystis et supérieure dans la sensibilité comparée à une tache modifiée de Wright et à une tache de GMS, mais ils ont rapporté un seul résultat faux-positif et donc une spécificité beaucoup plus élevée que nous décrivons. Il est possible qu’avec une pratique supplémentaire, on puisse reconnaître plus facilement les formes pathognomoniques avec la tache Diff-Quik, augmentant ainsi la sensibilité de ce test., De même, peut-être avec une expérience supplémentaire avec la tache de Mérifluor Pneumocystis, on pourrait apprendre à mieux faire la distinction entre la coloration vrai-positif et faux-positif et ainsi diminuer le nombre de résultats faux-positifs.

d’après notre expérience, les taches de Calcofluor blanc et GMS ont les meilleurs paramètres pour une utilisation de routine dans un laboratoire clinique. Bien que ces essais aient été moins sensibles que l’essai immunofluorescent, ils étaient très spécifiques et avaient des valeurs prédictives positives et négatives plus qu’acceptables.,

• Copyright © 2004 American Society for Microbiology