Qu’est-ce que la PCR? – Le Guide du débutant

la PCR est la technique des laboratoires de biologie moléculaire modernes. Si vous devez copier, séquencer ou quantifier L’ADN , vous devez connaître la PCR. En bref, la PCR (polymerase chain reaction) est une technique biochimique qui utilise le thermocyclage et les enzymes pour copier rapidement et de manière fiable l’ADN, et elle a été inventée en un éclair d’inspiration par un scientifique conduisant sur L’autoroute 128 de San Francisco à Mendocino.,

Cet article donne un bref aperçu de base de la PCR, avec quelques conseils pour vous aider à éviter les pièges les plus courants. Si vous êtes nouveau, ou relativement nouveau à la PCR alors c’est pour vous. (Et même si vous êtes expérimenté à la PCR, il vaut bien une lecture pour rafraîchir, et peut-être prendre un pourboire ou deux!).

ingrédients de base de la PCR:

polymérase

les polymérases sont des enzymes qui, dans les bonnes conditions, peuvent assembler de nouveaux brins d’ADN à partir d’ADN et de nucléotides. La réaction PCR originale était lourde parce que les températures élevées nécessaires pour dénaturer l’ADN tueraient les polymérases., Cela signifiait qu’après chaque cycle de chauffage, de nouvelles polymérases devaient être ajoutées manuellement à la réaction– une entreprise coûteuse. Cependant, dans la PCR moderne, ce n’est pas un problème, car les polymérases utilisées dans la PCR moderne proviennent généralement de l’une des deux sources de bactéries thermophiles, Thermus aquaticus ou Pyrococcus furiosus. Ces polymérases, respectivement, Taq (prononcé « tack”) et Pfu (prononcé « P-F-U”) résistent facilement aux températures élevées associées à une réaction PCR., Les polymérases Taq et Pfu commerciales sont conçues pour la vitesse, la fidélité, la processivité (capacité à effectuer de longues lectures) et leur capacité à lire des modèles riches en GC. Les entreprises sortent constamment avec de nouvelles polymérases. Par conséquent, ne vous contentez pas de « tout ce qui se trouve dans votre congélateur”, mais recherchez la meilleure polymérase commerciale pour vos besoins en PCR. Parlez également à votre représentant local, car il peut souvent donner des échantillons de polymérase gratuits, afin que vous puissiez décider ce qui vous convient le mieux.

ADN modèle

C’est l’ADN sur lequel vous concevez vos amorces., C’est l’ADN que votre polymérase va lire et copier. Votre ADN modèle peut être génomique, plasmidique ou ADNc, mais quelle que soit la qualité de votre source compte. Plus votre ADN de modèle est intact et pur, plus il est facile d’obtenir de bons résultats de PCR. Gardez également à l’esprit que la quantité idéale d’ADN dépendra de votre source, généralement 1 pg – 1 ng d’ADN plasmidique ou 1 ng – 1 µg d’ADN génomique par réaction PCR.

Amorces

Les amorces sont de courts fragments d’ADN synthétisé qui se lient à votre ADN modèle. Vous devrez concevoir un apprêt « avant” et un apprêt « arrière »., Votre amorce avant désigne le début de votre PCR. La séquence de cette amorce est la même que la séquence D’ADN de votre modèle 5-3. Votre amorce inverse désigne la fin de votre PCR. La séquence de cette amorce est le complément inverse de votre ADN modèle. En général, les amorces ont une longueur de 18 à 22 paires de bases. Cependant, plus important que leur longueur est la température de fusion de vos amorces. La température de fusion de vos amorces doit être de 54-60°C et aussi similaire que possible les unes aux autres., Il existe de nombreuses calculatrices en ligne qui peuvent calculer les températures de recuit des amorces, et la plupart des entreprises qui synthétisent des amorces fournissent de telles Calculatrices.

nucléotides

en tant que monomères de L’ADN, les nucléotides sont nécessaires pour faire des copies D’ADN. Pour la plupart des PCR ADN, vous utiliserez des triphosphates de Désoxynucléoside (dNTPs). Vous pouvez les acheter séparément ou en tant que mélange dGTP, dCTP, dATP et dTTP. Quoi que vous achetiez Cependant, gardez à l’esprit que les nucléotides sont très sensibles aux cycles de gel/dégel. Par conséquent, il est préférable de toujours créer de petites aliquotes de vos dNTP., Assurez – vous également que vous les stockez correctement-n’utilisez pas de congélateur sans gel qui passe par des cycles de dégivrage automatiques.

tampon

La plupart des polymérases commerciales sont fournies avec leur tampon idéal. Ces tampons fournissent non seulement le pH correct, mais ils ont toujours des additifs comme le magnésium, le potassium ou le DMSO, qui aident à optimiser la dénaturation de l’ADN, la renaturation et l’activité de la polymérase. Il y aura plus sur ces additifs dans un prochain article.

Thermocycling:

C’est là que la magie opère., Tous les ingrédients ci-dessus sont ajoutés à un tube de PCR et le tube est thermocyclé. Afin de réaliser le thermocyclage lorsque la PCR a été inventée pour la première fois, des tubes PCR individuels ont été déplacés manuellement entre les Bains d’eau chauffés. (Et vous pensez que votre travail au banc est fastidieux!) Maintenant, grâce à L’invention de « Mr.Cycles”, la première machine de thermocyclage, la régulation de la température est désormais effectuée automatiquement par des thermocycleurs. Voici un profil de Thermocycleur PCR typique:

initialisation

dans cette étape, la réaction est chauffée à 94-96°C pendant 30 secondes à plusieurs minutes., Cette étape n’est généralement effectuée qu’une seule fois au tout début de votre réaction PCR. Cette étape est importante pour activer les polymérases à démarrage à chaud, si vous utilisez une telle polymérase, et pour dénaturer votre ADN modèle. Gardez à l’esprit que si le contenu de votre template GC est élevé, vous devrez peut-être effectuer une étape d’initialisation très longue.

dénaturation (répétée 15-40 fois)

dans cette étape, la réaction est chauffée à 94-98°C pendant 15-30 secondes. Cette étape dénature votre ADN et vos amorces, ce qui leur permettra de se recuire les uns aux autres à l’étape suivante.,

recuit (répété 15-40 fois)

dans cette étape, la température de votre réaction est rapidement abaissée à 50-64°C pendant 20-40 secondes. La température à cette étape doit être suffisamment basse pour que vos amorces dénaturées puissent former des paires de bases Watson-Crick avec votre ADN de modèle. Mais suffisamment élevé pour que seules les structures D’ADN double brin les plus stables (parfaitement appariées) puissent se former. Habituellement, cette température de recuit parfaite est inférieure de quelques degrés à la température de fusion de votre paire d’amorces. Également au cours de cette étape, votre polymérase se lie à votre complexe d’ADN primer/template., Bien que votre polymérase ne commence pas à lire tant que la température n’est pas élevée à l’étape suivante.

allongement ou Extension (répété 15-40 fois)

dans cette étape, votre réaction est rapidement chauffée à 72-80°c. c’est à ce moment que votre polymérase commencera à lire (dans la direction 5-3) et à copier votre ADN modèle (dans la direction 3-5). La température plus élevée au cours de cette étape réduit les interactions ADN primer/template non spécifiques, augmentant ainsi la spécificité de votre réaction., Cependant, la température exacte sera déterminée par la préférence de votre polymérase, alors lisez votre emballage. La durée de cette étape dépend de la durée de votre copie ADN. En règle générale, L’ADN polymérase peut copier 1 000 paires de bases par minute. Par conséquent, vous devez prévoir au moins 1 minute de temps de prolongation pour 1 000 bases. À la fin de cette incubation, de nouveaux morceaux d’ADN double brin auront été créés, constitués à la fois de modèle et de nouvel ADN.

les étapes 2-4 sont ensuite répétées 15-40 fois

Il est vrai que plus vous programmez de cycles, plus vous créerez de copies D’ADN., Cependant, il existe une limite supérieure. À un moment donné, les nucléotides libres disponibles deviennent limitatifs et les copies d’ADN prématurément tronquées peuvent devenir un problème. Donc ne soyez pas gourmand avec votre vélo. Moins mais bon produit PCR propre est préférable à beaucoup de produit sale.

allongement Final

Il s’agit d’une étape facultative mais souvent recommandée. Dans cette étape, la réaction est maintenue à 70-74°C pendant plusieurs minutes. (Habituellement vous emploierez la même température que vous avez employée dans l’étape D’élongation ou D’Extension.) Cette étape permet aux polymérases de terminer la lecture quel que soit le brin sur lequel elles se trouvent actuellement., Cette étape facultative peut aider à réduire le nombre de copies tronquées dans votre produit final.

dernière prise

Votre réaction est maintenant terminée. Étant donné que l’ensemble du processus peut prendre quelques heures, les réactions de PCR se font souvent pendant la nuit ou lorsque vous vous êtes éloigné; il est recommandé de programmer votre thermocycleur pour maintenir votre produit de PCR à 4°C jusqu’à votre retour. À ce moment-là, vous pouvez analyser ou utiliser votre produit, ou le transférer dans un stockage à long terme plus approprié comme votre réfrigérateur.

bonne chance et Bonne PCR-ing!