« le séquençage de l’ARN est une méthode de séquençage de nouvelle génération à haut débit utilisée pour analyser l’expression des gènes et les études transcriptomiques.”
l’acide ribonucléique est un type d’acide nucléique principalement impliqué dans l’expression des gènes, la régulation des gènes et le codage/décodage de l’information.
ARNm – ARN messager est une séquence codante d’un gène impliqué dans la synthèse des protéines, environ, 4% du pool D’ARN est constitué d’ARNm tandis que les autres sont des ARN non codants.,
bien qu’environ 90% des ARN ne soient pas codants, ceux-ci sont importants pour remplir diverses fonctions.
Par exemple,
- ARNt – transfère l’acide aminé au site ribosomique, tandis que la traduction.
- ARNr – ARN ribosomique aide à la traduction.
- microARN – expression génique et régulation de l’expression génique.
- ARNsi – protège une cellule des ARN exogènes.
un ARNm est un acide nucléique monocaténaire transcrit à partir d’un gène et à partir duquel la protéine est traduite.,
l’ARNm ou la transcription ne contient que les séquences codantes d’un gène. Ainsi, il ne possède que les séquences nécessaires à la formation des protéines.
désormais, en analysant un ARNm, le patron d’expression du gène apparenté peut être déterminé.
En outre, l’examen de L’ARN total nous donne une idée des gènes liés à la formation des protéines et de ceux qui ne le sont pas.
signifie que la quantité d’ARN total, d’ARNm et d’ARNC peut être déterminée en étudiant l’ARN total.,
la transcriptomique est l’étude de l’ARNm entier – souvent appelé transcriptomes ou ARN total présent dans une cellule ou une population cellulaire.
en analysant le transcriptome d’une cellule, l’ensemble de l’expression du gène peut être examiné. L’une des techniques importantes utilisées dans les études transcriptomiques est le séquençage de l’ARN.
le transcriptome d’un organisme est plus grand, complexe et plus incertain, contrairement au génome.
le transcriptome varie dans des conditions et un environnement différents., Le mode de vie, l’alimentation, l’exercice, l’environnement, les conditions et d’autres facteurs externes jouent un rôle important dans la régulation du transcriptome.
ici, dans le séquençage de L’ARN, l’ADNc synthétisé à partir de l’ARNm est séquencé et quantifié dans un séquenceur. Dans le présent article, nous discuterons uniquement du séquençage de L’ARN, mais avant cela, lisez notre article précédent sur la transcriptomique: Qu’est-ce que la transcriptomique?,
sujets clés:
principe du séquençage de l’ARN:
le séquençage de l’ARN est une méthode de séquençage et de quantification de l’ARN à haut débit de nouvelle génération utilisée pour étudier la transcriptomique et l’expression des gènes.
un ADNc est construit à partir de l’ARNm total par le processus de transcription inverse et fragmenté. La ligature simultanée de l’adaptateur et la préparation de la bibliothèque sont pratiquées avant le séquençage.
Le séquenceur lit et quantifie l’adnc complémentaire à l’arnm.,
Steps in RNA-seq:
- RNA isolation
- cDNA synthesis
- Adaptor ligation
- Library preparation
- DNA fragmentation
- Sequencing
- Downstream applications
RNA isolation:
The first step in the RNA sequencing is the isolation of total RNA, mRNA or ncRNA for the experiment.,
L’isolement de L’ARN est un processus fastidieux par rapport à l’isolement de l’ADN. L’ARN peut être en panne facilement. En outre, le risque de contamination est élevé dans l’isolement de L’ARN.
ainsi, des précautions supplémentaires doivent être prises lors de l’isolement de L’ARN et une main experte requise pour le faire.
L’ARN pur à haut rendement est nécessaire pour le séquençage de L’ARN.
la pureté et la quantité de L’ARN sont mesurées à L’aide du Nanodrop ou du qubit.
Note: for isolating mRNA from the total RNA pool, one additional step is required, using the oligo dT specific column in the purification or final step of elution, total mRNA can be isolated from the rest of RNAs.
Maintenant, notre échantillon d’ARN est prêt pour la prochaine étape.,
reverse transcriptase PCR:
Une autre solution innovante pour le séquençage de L’ARN consiste à effectuer une PCR reverse transcriptase dans laquelle l’ARN est transcrit en ADN.
en utilisant un type spécial de polymérase appelée ADN transcriptase inverse, l’ADNc est synthétisé à partir de l’ARNm.
En savoir plus sur RT PCR ici: Reverse transcriptase PCR.
synthèse de l’ADNc du deuxième brin:
Après la synthèse de l’ADNc à partir de l’ARNm, la synthèse de l’ADN du deuxième brin est nécessaire. Pour cela, la PCR est réalisée en utilisant L’ADN polymérase Taq normale dans la PCR conventionnelle.,
la polymérase ajoute des dNTP au brin D’ADN en croissance à l’aide de l’ensemble d’amorces.
préparation de la bibliothèque:
la première étape de la préparation de la bibliothèque ou de la préparation de la bibliothèque NGS commence par les fragmentations.
en utilisant le type spécial d’endonucléases de restriction, l’ensemble de l’ADNc ds est fragmenté pour le NGS.
Remarque:
la préparation de la bibliothèque varie d’une plate-forme à l’autre, car certains fragments d’ARNm avant d’effectuer la transcriptase inverse, tandis que d’autres l’effectuent plus tard après la préparation de l’ADNc.,
dans la dernière étape de la préparation de la bibliothèque, les extrémités sont ligaturées avec les séquences d’adaptateur et amplifiées pour réparer les extrémités. dA-tailing est facultatif dans le cas d’une bibliothèque d’ARNm.
purification de la bibliothèque:
toute la Bibliothèque est purifiée à l’aide du kit de purification de L’ADN prêt à l’emploi.
dans la dernière étape, il est très crucial de purifier l’ensemble de la bibliothèque de fragments pour que la concentration de la bibliothèque soit évaluée à l’aide de la PCR quantitative ou du bioanalyseur.,
Remarque:
pour un débutant, je pense que la préparation de la bibliothèque et la fragmentation de l’ADN est très difficile à comprendre, nous pensons donc que nous devrions écrire un article entier sur la fragmentation de l’ADN génomique, la préparation de la bibliothèque et son importance dans NGS.
de toute façon, allons de l’avant,
dans l’étape suivante, l’échantillon d’ADN fragmenté est envoyé pour le séquençage.
séquençage de L’ADN:
maintenant, l’échantillon est séquencé dans la machine NGS à haut débit qui lit la séquence et quantifie également l’acide nucléique.,
la chimie derrière le séquençage de l’ADNc dépend des plates-formes que nous utilisons, bien que la méthode largement utilisée soit l’utilisation de la chimie de fluorescence.
dans le séquenceur, les fragments individuels sont « lus” séparément et séquencés. Les données finales sont envoyées au Laboratoire de bioinformatique pour analyse post-séquençage.,
Different types of RNA and its function:
| Abbreviation | RNA types | Function |
| mRNA | Messenger RNA | Codes for protein |
| tRNA | Transfer RNA | Transfer amino acid to the site of translation., |
| rRNA | Ribosomal RNA | Catalyse the translation reaction |
| miRNA | microRNA | Gene regulation |
| siRNA | Smaller interfering RNA | Gene regulation and maintaining gene expression. |
| LncRNA | Long non-coding RNA | Transcriptional regulation and epigenetic regulations., |
| snRNA | Small nuclear RNA | Helps in mRNA splicing and related functions |
| snoRNA | Small nucleolar RNA | Helps in RNA nucleotide modification |
| piRNA | Piwi-intercalating RNA | Function in defence against transposon; transposon defence system. |
| scaRNA | Small Cajal body-specific RNA | Also helps in nucleotide modifications (a type of snoRNA)., |
| shRNA | petit ARN en épingle à cheveux | la molécule D’ARN synthétique aide à la régulation et au contrôle de l’expression des gènes. |
Transcriptome de l’analyse de données:
l’Un des fastidieuse emplois, comme nous l’avons déjà discuté dans l’article précédent est le transcriptome de l’analyse des données et interprétation des résultats. Les données NGS sont énormes et plus complexes.,
franchement parlant, l’enseignement de l’analyse des données de la transcriptomique n’est pas possible, il faut prendre la pratique pratique pour apprendre, encore, je vais essayer de vous enseigner ce qui est ensuite dans ce processus.
différents fragments sont séquencés dans la machine et les données sont collectées. Dans l’étape suivante, en fonction de la région flanquante des fragments, les soi-disant « contings” sont disposés pour obtenir des variantes d’épissure.
dans l’étape suivante, le transcriptome est comparé à la séquence de référence ou peut être assemblé de novo.,
Un bref aperçu de l’ensemble du processus de l’ARN-seq.
séquençage du transcriptome entier:
le transcriptome entier d’une cellule ou d’un tissu – tous les ARN (ARNm, ARNt, ARNr, arnsnc, microARN et ARNsi) sont séquencés et quantifiés. En d’autres termes, nous pouvons dire que les transcriptions nouvelles, ainsi que les transcriptions connues, peuvent être séquencées.
Pour le faire, l’ensemble de l’ARN est extrait de l’échantillon de tissu.,
séquençage de L’ARN cible:
Un groupe de transcriptomes spécifiques à un gène, spécifiques à une voie ou liés à une maladie sont séquencés dans le séquençage de l’ARN spécifique à la cible.
Le séquençage de L’ARN cible est plus abordable et plus précis que le séquençage du transcriptome entier. De plus, moins de quantité d’échantillon D’ARN est nécessaire pour faire l’expérience.
séquençage de petits ARN:
l’une des techniques les plus émergentes en séquençage D’ARN consiste à étudier les ARN non codants plus petits d’une cellule, car ceux-ci sont associés à tant de fonctions dans un génome.,
des molécules D’ARN plus petites telles que le miRNA, le siRNA et le piRNA peuvent être quantifiées et séquencées par la méthode de séquençage D’ARN basée sur le NGS pour diverses applications.
séquençage de l’ARNm:
séquencer la transcription entière de l’ARNm en utilisant la sélection de la queue poly(A) utilisée pour les études d’expression génique. En utilisant le séquençage de l’ARNm connu ainsi que de nouvelles modifications de transcription peuvent être détectées.
avantages du séquençage de L’ARN:
l’un des principaux avantages du séquençage de l’ARN est l’absence d’information préalable sur la séquence., Comme l’ensemble du processus n’est pas basé sur la chimie basée sur la Sonde, les informations de séquence préalables pour la conception de la sonde ne sont pas requises ici.
Une étude plus précise et plus sensible de l’expression des gènes peut être effectuée.
plus Large gamme dynamique.
capturer à la fois des altérations connues et nouvelles de la transcription, même si aucune information de séquence n’est disponible.
même si aucune information de séquence de référence n’est disponible, le séquençage de L’ARN peut être appliqué pour n’importe quelle espèce.
connexes: génome synthétique – méthodes, Applications et défis.,
Conclusion:
de manière concluante, nous pouvons dire que la méthode RNA seq est plus avancée et plus précise que la micropuce. En outre, des mutations de novo peuvent également être découvertes en l’utilisant.