lignées cellulaires
la lignée cellulaire HEK 293T a été obtenue à partir de la collection de culture de type américain (ATCC CRL – 3216). Les lignées cellulaires D’hybridomes de souris KT13 et KT22 ont été obtenues à partir des études développementales Hybridoma Bank (Dshb). Les deux lignées cellulaires ont été déposées dans la DSHB par Kazumasa Takeda et Asako Sugimoto (produits dshb hybridoma KT13 et KT22)., Miha Kosmač et Vladka Čurin Šerbec (Université de Ljubljana) ont gentiment fourni la lignée cellulaire 5E4/1F1 d’hybridome de souris. Des cellules de HEK 293T et d’hybridome ont été cultivées dans du DMEM (Gibco) additionné de 13% de FBS (Gibco), de 1× pénicilline/streptomycine (Thermo Fisher) et de 1× GlutaMAX (Gibco). Les séquences d’anticorps HC et LC provenant d’hybridomes individuels ont été déterminées par réaction en chaîne par polymérase de transcription inverse (RT-PCR) et séquençage capillaire (Eurofins Genomics).,
traitement du Cycloheximide et préparation du microsome
toutes les étapes de pipetage ont été effectuées sur glace et les centrifugations ont été effectuées à 4 °C à l’aide d’une centrifugeuse Eppendorf 5810r à rotor à angle fixe F-45-30-11. Des tubes à centrifuger Protein LoBind de 1,5 mL (Eppendorf) ont été utilisés pour minimiser l’adhérence des cellules aux parois des tubes. Cellules HEK 293T( 1 million), cellules d’hybridome de souris (1 million de cellules 5E4, KT13 et KT22 mélangées dans un rapport 1:1:1), cellules de leucémie ARH-77 (ATCC CRL-1621, 1 million) ou cellules CD19+ B humaines fraîchement isolées à partir d’échantillons d’immunisation pré et post Td – booster (1.,5 millions chacun) ont été remis en suspension dans 1 mL de PBS avec 50 µg/mL de cycloheximide et incubés pendant 10 min pour bloquer les ribosomes avec les ARN messagers associés (ARNm) au niveau du réticulum endoplasmique rugueux. Les cellules ont été granulées avec 300 g pendant 10 min à 4 °C et remises en suspension par pipetage 15× de haut en bas dans un tampon de lyse haute densité de 120 µL (25 mM HEPES-KOH pH 7,2, 110 mM acétate de potassium, 5 mM acétate de magnésium, 1 mM EGTA, 25% de saccharose , 5% de glycérol, 1 mM 1,4-dithiothréitol, 1× cocktail complet d’inhibiteurs de protéase sans EDTA , 0,1 mg/mL de cycloheximide, 0,015% de digitonine et 400 U/ml d’inhibiteur de la RNase ribolock )., La lyse des cellules et des organites a été complétée par une incubation de 10 min sur de la glace. Chaque homogénat a été divisé en deux aliquotes de 55 µL et transféré dans deux tubes lobind de protéines fraîches. Les tubes ont été centrifugés à 600 g pendant 3 min à 4 °C pour former des noyaux de granules et des débris cellulaires. Un total de 40 µL de surnageant provenant de chaque tube, contenant des fractions membranaires et du cytosol, ont été transférés dans des tubes de Lobind protéique frais et la concentration de saccharose a été diluée à 0,37–0,40 M (12-13% P/P) par addition d’eau sans nucléase de 40 µL. Les Microsomes ont ensuite été sédimentés par centrifugation à 20 800 g pendant 120 min à 4 °C., Les surnageants contenant du cytosol ont été jetés et les pastilles membranaires ont été remises en suspension en pipetant 10× de haut en bas dans un tampon de lavage de 85 µL (25 mM HEPES-KOH pH 7,2, 110 mm acétate de potassium, 2,5 mM acétate de magnésium, 1 mM EGTA, 1 mM 1,4-dithiothréitol, 1× cocktail complet d’inhibiteurs de protéase sans EDTA, 0,1 mg/mL de cycloheximide, 0,004% de digitonine et 400 U/ml de RiboLock inhibiteur de la RNase). Les microsomes ont été sédimentés à nouveau par centrifugation à 20 800 g pendant 60 min à 4 °C., Les surnageants ont été jetés et les granulés de microsomes ont été remis en suspension dans 20 µL de tampon de lavage et conservés sur de la glace jusqu’à leur utilisation ultérieure.
microscopie électronique à Transmission
des aliquotes D’échantillons de 3,5 µL de microsomes HEK 293T remis en suspension ont été appliquées sur des grilles de Quantifoil fraîchement déchargées (Quantifoil, Allemagne) recouvertes d’un film de support de carbone supplémentaire de 2 nm et congelées dans de l’éthane liquide à l’aide d’un piston Vitrobot (FEI). Les échantillons ont été imagés sur un microscope électronique à transmission Tecnai Spirit (Fei) fonctionnant à 120 kV équipé d’une caméra CCD Eagle 2 × 2 K (FEI)., Des micrographies ont été enregistrées dans des conditions cryo à faible dose à un grossissement nominal de 42 000× (taille de pixel à l’échelle de l’objet: 5,2 Å/px) en appliquant un défocus de − 2 à − 4 µm. La collecte des données a été effectuée manuellement ou entièrement automatiquement à l’aide de Leginon .
assemblage de RT-PCR en émulsion à l’aide de microsomes d’hybridomes de souris
Nous avons dilué 16 µL de microsomes remis en suspension à partir d’hybridomes mixtes 5E4, KT13 et KT22 dans 184 µL de RT-PCR master mix contenant 1× verso 1-Step RT-PCR master mix (Thermo Scientific), 1× Verso enzyme mix (Thermo Scientific), 0.,5 µg / µL de BSA, 100 µg/mL de cycloheximide et amorces pour la transcription inverse et l’assemblage HC et LC (0,8 µM chacune des amorces TitA_MID1_IgM_rev et TitB_MID12_IgK_rev; 0,16 µM chacune des amorces OE_MHV_fwd et OE_MKV_fwd). Les séquences d’amorces sont présentées dans le fichier supplémentaire 1: Figure S1a. les 200 µL de solution aqueuse résultants ont été utilisés pour former une émulsion eau-dans-huile par addition goutte à goutte (13 aliquotes de 15 µL à intervalles de 30 s) à la phase huileuse de 800 µL selon Ge et al. (Huile minérale, Sigma M5904, avec 4,5% Span 80, Sigma S6760, 0,4% Tween 80, Sigma P8074 et 0.,05% Triton X-100, Sigma T8787) pendant l’agitation continue sur un agitateur magnétique., Six aliquotes de 100 µL chacune de l’émulsion résultante ont été transférées dans des tubes de PCR et soumises à un thermocyclage avec les conditions suivantes: transcription inverse à 50 °C pendant 15 min, inactivation de la RTase à 95 °C pendant 2 min, puis quatre cycles de dénaturation à 95 °C pendant 20 s, recuit rampe de 60 °C à 50 °C pendant 50 s et extension à 72 °C pendant 1 min, puis 16 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 20 s, recuit à 60 °C pendant 30 s et extension à 72 °C pendant 1 min, suivie d’une dernière étape d’extension à 72 °C pendant 5 min., En parallèle, un contrôle RT-PCR ouvert a été réalisé en diluant 4 µL de microsomes remis en suspension dans un mélange maître RT-PCR de 46 µL et en thermocyclant la réaction en parallèle avec L’émulsion RT-PCR. Des produits D’assemblage PCR ont été extraits de l’émulsion à l’aide d’isobutanol (2-méthyl-1-propanol, Sigma) et du kit concentrateur-5 Zymo DNA Clean & tel que publié précédemment . L’ADN résultant et le produit de PCR provenant du contrôle de PCR ouvert ont été chargés sur un gel de TBE-agarose à 1,2% et séparés avec 90 V pendant 60 min., Les produits d’assemblage d’une taille de 800 à 950 PB ont été sélectionnés dans le gel d’agarose et les produits ont été récupérés à l’aide d’un kit de récupération D’ADN en Gel Zymoclean. Les produits d’assemblage ont été élués dans un Tris-Cl de 6 mM pH 8 et stockés à − 20 °C jusqu’à une analyse plus approfondie.,
amplification par PCR imbriquée de produits d’assemblage d’hybridomes de souris
Après la réaction d’assemblage en émulsion, les produits d’assemblage ont été amplifiés avec des amorces d’adaptateur TitA_fwd, 5′ CGT ATC GCC TCC CTC GCG CCA TCA g 3′, et TitB_rev, 5′ CTA TGC GCC TTG CCA conditions de thermocyclage: dénaturation initiale à 98 °C pendant 30 s, puis 15 cycles de dénaturation à 98 °C pendant 7 s et recuit/extension à 72 °C pendant 30 S, suivi D’une étape D’extension finale à 72 °C pendant 5 min., Les produits PCR ont été purifiés avec le kit concentrateur-5 Zymo DNA Clean &. L’appariement de HC et de LC dans les produits d’assemblage a ensuite été analysé par PCR à l’aide d’amorces imbriquées spécifiques aux trois différents HC et trois différents LC (fichier supplémentaire 1: Figure S1e) à L’aide du kit Phusion D’ADN polymérase haute fidélité avec les conditions de thermocyclage suivantes: dénaturation initiale à 98 °C pendant 30 s, puis 24 cycles de dénaturation à 98 °C pendant 7 s et recuit/extension à 72 °C pendant 30 s, suivi d’une étape d’extension finale à 72 °C pendant 5 min., Les produits de PCR imbriqués ont été chargés sur un gel de TBE-agarose à 1,2% et séparés avec 90 V pendant 40 min. La PCR imbriquée en temps réel pour la quantification de la contamination croisée a été réalisée en triplicats avec les mêmes amorces imbriquées en utilisant SYBRGreen master mix (Applied Biosystems) sur un cycleur StepOne qPCR (Applied Biosystems) avec les conditions de thermocyclage suivantes: dénaturation initiale à 95 °C pendant 10 min, suivie de 40 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 15 s, recuit à 56 °C pendant 30 s et extension à 72 °C pendant 45 s., Les abondances initiales des produits d’assemblage amplifiés ont été calculées à l’aide de la méthode 2^(-deltaCt) et tracées sous forme de graphiques à barres avec des barres d’erreur montrant l’écart-type par rapport à la moyenne.
immunisation et isolement des cellules CD19+ B à partir d’échantillons de sang total périphérique
Les échantillons de sang total périphérique humain utilisés dans cette étude ont été obtenus à partir de in.vent Diagnostica GmbH en tant que sous-produits de procédures de diagnostic de routine. dans.,vent Diagnostica GmbH a obtenu par écrit le consentement éclairé du donneur pour l’utilisation des sous-produits à des fins de recherche et a obtenu l’approbation éthique de la Commission D’éthique internationale de Fribourg (code FEKI 011/1763) pour la distribution des échantillons. Un proband sain a subi une immunisation de rappel avec anatoxine tétanique (TT)/anatoxine Diptérique (DT) (Td-pur®; 20 unités internationales TT et 2 UI DT; Novartis, Bâle, Suisse)., Le sang total périphérique K2-EDTA dérivé de la pré-vaccination (jour 0) et sept jours après la vaccination de rappel Td ont été utilisés pour isoler les cellules CD19+ B à l’aide du kit de séparation cellulaire PLURIBEAD CD19 (pluriSelect GmbH, Leipzig, Allemagne) suivant le protocole du fabricant. Les pastilles de cellules B CD19 + isolées ont été lavées dans 1 mL de PBS froid et centrifugées à 300 g pendant 10 min à 4 °C. Les pastilles de cellules correspondant à 1,5 million de cellules B provenant d’échantillons pré – et post-immunisation ont été conservées sur glace jusqu’au traitement par cycloheximide et à la préparation du microsome.,
assemblage RT-PCR en émulsion à l’aide de microsomes humains de cellules B
Nous avons ajouté 2 µL de microsomes dilués préparés à partir de cellules ARH-77 congelées (comme contrôle d’appariement interne) à 26 µL de microsomes remis en suspension à partir de cellules B avant et après l’immunisation Td, de sorte que la fraction finale de microsomes ARH – 77 est de 0,5% (v / v). Nous avons dilué 16 µL de cette suspension de microsomes dans 184 µL de mélange maître RT-PCR contenant 1× DART 1-step RT-PCR master buffer mix (Roboklon), 2× Dart master enzyme mix (Roboklon), 0.,5 µg/µL de BSA, 100 µg/mL de cycloheximide et amorces pour la transcription inverse (IgM, IgG et IgK) et l’assemblage lourd (VH) et à chaîne légère (VK). Les séquences d’amorces et les concentrations dans le mélange maître RT-PCR sont énumérées dans le fichier supplémentaire 1: Tableau S2., Les 200 µL de solution aqueuse résultants ont été utilisés pour former une émulsion eau-dans-huile par addition goutte à goutte (13 aliquotes de 15 µL à intervalles de 30 s) à une phase huileuse de 800 µL composée de 73% d’émulsion composant 1, 7% d’émulsion composant 2 et 20% d’émulsion composant 3 du kit D’émulsion et de purification D’ADN Micellula (Roboklon) lors d’une agitation continue sur un agitateur magnétique., Six aliquotes de 100 µL chacune de l’émulsion résultante ont été transférées dans des tubes PCR et soumises à un thermocyclage dans les conditions suivantes: transcription inverse à 55 °C pendant 30 min, dénaturation initiale à 95 °C pendant 3 min, puis trois cycles de dénaturation à 95 °C pendant 20 s, recuit à 56 °C pendant 30 s et extension à 72 °C pendant 2 min, puis 20 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 20 s, recuit à 56 °C pendant 30 s et extension à 72 °C pendant 4 min, suivie d’une dernière étape d’extension à 72 °C pendant 5 min., Des produits D’assemblage PCR ont été extraits de l’émulsion à l’aide d’isobutanol (2-méthyl-1-propanol, Sigma) et du kit concentrateur-5 Zymo DNA Clean & tel que publié précédemment . Les ADN obtenus ont été chargés sur un gel de TBE-agarose à 1% et séparés avec 100 V pendant 45 min. Les produits d’assemblage de 700-800 PB ont été sélectionnés dans le gel d’agarose, récupérés à l’aide d’un kit de récupération D’ADN en Gel Zymoclean, élués dans un Tris-Cl de 6 mM pH 8 et stockés à − 20 °C jusqu’à une analyse plus approfondie.,
amplification par PCR imbriquée de produits d’assemblage de cellules B humaines
Pour une amplification supplémentaire spécifique des produits D’assemblage HC-LC, une amplification par PCR imbriquée a été réalisée avec des amorces imbriquées spécifiques aux régions constantes IgM, IgG et IGK (fichier supplémentaire 1: Tableau S2). La réaction PCR contenait des amorces imbriquées à des concentrations de 0,4 µM, un mélange de dNTP de 200 µM, un tampon de réaction de 1× Q5 et une ADN polymérase haute fidélité de 0,02 U/µL Q5 (New England Biolabs) dans un volume de réaction de 50 µL avec 3 µL d’ADN assemblé., L’amplification par PCR imbriquée a été réalisée avec les conditions de thermocyclage suivantes: dénaturation initiale à 98 °C pendant 3 min, puis 34 cycles de dénaturation à 98 °C pendant 30 s et recuit/extension à 71 °C pendant 1 min, suivi d’une étape d’extension finale à 72 °C pendant 5 min. Les échantillons ont été prélevés après trois cycles de PCR différents (28, 31 et 34 cycles). Les produits de PCR amplifiés ont été chargés sur des gels de TBE-agarose à 1% et séparés avec 100 V pendant 60 min., Les produits souhaités de ~ 710 PB ont été extraits comme décrit ci-dessus, des bibliothèques de séquençage ont été préparées en suivant le guide de préparation des échantillons D’ADN Illumina TruSeq et 2 × 250 lectures d’extrémité appariée de base ont été séquencées à l’aide de la plate-forme Illumina MiSeq.
analyse bioinformatique des répertoires de chaînes lourdes et légères d’anticorps appariés
le démultiplexage de 2 × 250 lectures d’extrémité appariée de base à partir de la plate-forme de séquençage MiSeq a été effectué sur la base d’indices d’adaptateur et les données de séquençage ont été obtenues au format fastq., Seules les lectures avec des scores de qualité Phred minimum de 10 sur 50% de tous les nucléotides ont été conservées et scannées pour les séquences de région constante IgM, IgG et IgK. Les paires de lecture dépourvues de séquences de régions constantes ou présentant une structure HC-HC ou LC-LC ont été filtrées et les lectures restantes ont été converties en format fastq et utilisées comme entrée pour l’analyse avec MiXCR (v1.2) pour l’alignement des lectures sur les séquences de gènes V(D)J et C de la base de données IMGT , l’extraction et le regroupement du nucléotide CDR-H3 (fichier supplémentaire 1: Tableau S1)., Les séquences HC-CDR3 contenant des frameshifts ou des codons stop et avec moins de deux lectures ont été filtrées. Nous avons créé un fichier de statistiques d’appariement HC-LC pour démontrer l’utilisation des gènes VH-VK appariés dans le répertoire total des gènes HC-LC appariés. Les cartes thermiques ont été générées à L’aide de R et affichées graphiquement à l’aide de ggplot2. Ensuite, on a identifié des séquences d’HC-CDR3 spécifiques au TT entre individus en comparant des séquences d’acides aminés HC-CDR3 obtenues à partir de l’échantillon de rappel d’immunisation post-Td à des séquences d’HC-CDR3 spécifiques au tt rapportées précédemment .,
amplification par PCR de séquences complètes de HC et de LC
Nous avons conçu une méthode D’amplification par PCR en deux étapes (fichier supplémentaire 1: Figure S5) pour incorporer des sites de digestion par restriction à des HC et des LC potentiellement spécifiques au TT avec une séquence complète du gène V(D)J. Cela a permis un clonage efficace des séquences HC et LC dans des vecteurs d’expression respectifs ainsi que la production d’anticorps recombinants pour des études de liaison in vitro., En bref, nous avons sélectionné 14 clonotypes HC-LC CDR3 appariés obtenus à partir du séquençage des IgG après l’immunisation de rappel Td en fonction de leur fréquence, de la précision de l’appariement et de la différence de pli entre top1 LC-CDR3 et top2 LC-CDR3 appariés à la séquence HC-CDR3 donnée. Nous avons extrait L’ARN total des cellules B congelées isolées de l’immunisation de rappel post-Td en utilisant la purification du réactif de TRIzol (Ambion) conformément aux instructions du fabricant. Dans la première étape, l’amplification RT-PCR pour chaque clonotype HC – et LC-CDR3 sélectionné a été réalisée séparément à l’aide du kit RT-PCR en 1 étape Dart (Roboklon)., Le mélange maître RT-PCR (25 µL) contenait des amorces directes spécifiques au gène HC et LC V avec des surplombs du site de restriction BssHII ainsi que des amorces inverses spécifiques au CDR3 avec 18 nucléotides de la région FR4 à des concentrations de 0,4 µM (fichier supplémentaire 1: Tableau S3 et Figure S5), 1× mélange tampon maître RT-PCR en 1 étape DART, 1× mélange enzymatique maître dART et 4,5 NG D’ARN total., Les conditions de thermocyclage étaient les suivantes: transcription inverse à 55 °C pendant 30 min, dénaturation initiale à 95 °C pendant 3 min, puis 23 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 20 s, recuit à 56 °C pendant 30 s et extension à 72 °C pendant 90 s, suivi d’une étape d’extension finale à 72 °C pendant 5 min. Les produits RT-PCR ont été purifiés à L’aide du kit de purification Agencourt AMPURE XP-PCR (Beckman Coulter) suivant les instructions du fabricant et élués en 6 mM Tris-Cl pH 8.0., Dans la deuxième étape, des produits RT-PCR purifiés ont été utilisés comme modèle pour l’amplification PCR à L’aide de L’ADN polymérase haute fidélité Q5 (New England Biolabs). Le mélange maître de PCR imbriqué (50 µL) contenait des amorces avant codant un site de restriction BssHII et trois nucléotides de séquence de gènes germinaux HC ou LC ainsi que des amorces inverses contenant la région FR4 complète et des surplombs de restriction Nhei/HindIII à des concentrations de 0,4 µM (fichier supplémentaire 1: Tableau S3 et Figure S5), 4 µL d’ADN purifié, 200 µM de mélange dNTP, 1× tampon de réaction Q5 et 0.,02 U / µL Q5 ADN polymérase haute fidélité (New England Biolabs). Les conditions de thermocyclage étaient les suivantes: dénaturation initiale à 98 °C pendant 3 min, puis 16 cycles de dénaturation à 98 °C pendant 30 s, recuit à 69 °C pendant 30 s et extension à 72 °C pendant 1 min, suivi d’une dernière étape d’extension à 72 °C pendant 5 min. Les produits de PCR ont été séparés sur un gel de TBE-agarose, des amplicons HC et LC sur toute la longueur avec des sites de digestion par restriction ont été extraits du gel à l’aide du kit de récupération D’ADN du Gel Zymoclean (Zymo Research) et les produits ont été stockés à − 20 °C jusqu’à leur utilisation ultérieure.,
clonage et expression d’anticorps monoclonaux recombinants
la digestion par restriction des inserts HC et LC sur toute leur longueur et des vecteurs d’expression (pCMV-CD30-4IE3_HC et pCMV-CD30-4ie3_lc) a été réalisée avec les enzymes de restriction BssHII, NheI et HindIII (New England Biolabs). Les produits résultants ont été chargés sur 2% de gels TBE-agarose et des bandes de ~ 5,9 kb pour le squelette vectoriel HC, 5,3 kb pour le squelette vectoriel LC, ~ 370 PB pour les inserts HC et ~ 340 PB pour les inserts LC ont été sélectionnées sur des gels d’agarose et purifiées comme décrit ci-dessus., Les ligatures des inserts et vecteurs correspondants pour les clonotypes HC et LC amplifiés ont été effectuées à l’aide d’ADN ligase à extrémité collante instantanée (New England Biolabs) et transformées en cellules TOP10 d’E. coli à capacité chimique unique (IBA) suivant les instructions du fabricant. Les ADN plasmidiques ont été isolés à partir de colonies transformées (8-16 colonies) à l’aide du kit QIAprep spin miniprep (Qiagen); des similitudes avec les séquences consensuelles ont été confirmées à l’aide du séquençage capillaire de Sanger., Les séquences d’ADN plasmidique HC et LC qui correspondaient le plus près des séquences consensuelles ont été co-transfectées dans des cellules rénales embryonnaires humaines de la lignée HEK 293 t (ATCC, CRL-11268). Les lymphocytes T HEK 293 ont été cultivés en utilisant du glucose riche (4,5 g/L D-glucose) du milieu D’Aigle modifié de Dulbecco (Gibco BRL) complété par du sérum fœtal bovin à très faible IgG inactivé par la chaleur (Thermo Fisher Scientific), 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine. Les ADN plasmidiques purifiés des clonotypes HC et LC appariés ont été co-transfectés dans 85 à 95% des lymphocytes T HEK 293 confluents à l’aide de PEI (polyéthylèneamine, Polysciences)., Des surnageants de Culture ont été prélevés quatre jours après la transfection et des clonotypes spécifiques à l’antigène TT ont été identifiés par ELISA indirect.
tests Immunosorbants enzymatiques (ELISA)
Nous avons effectué des tests ELISA indirects pour identifier les MAB dérivées du proband immunisé se liant à l’antigène TT en utilisant les surnageants de culture cellulaire transfectée. Des plaques solides Nunc-Immuno MicroWell à 96 puits (Thermo Fisher Scientific) ont été recouvertes de 100 µL d’antigène TT à 10 µg/mL (Statens Serum Institute, Copenhague, Danemark) dans un tampon carbonate de 50 mM pH 9.,6, incubé toute la nuit à 4 °c, lavé trois fois avec du PBS et Bloqué avec 2% de lait en poudre non gras (Bio-Rad) dans du PBS pendant 150 min à température ambiante. Après blocage, 120 µL de surnageants transfectés dilués en série 1:2 dans du PTM (PBS, 0,1% Tween-20, 2% de lait séché non gras) ont été ajoutés aux puits, 350 ng DE MAB anti-TT de souris (GeneTex) ont été appliqués sur un puits en tant que témoin positif, et des plaques ont été incubées pendant 1 h à température ambiante. Les plaques ont été lavées trois fois avec du PBS-T (0.,1% Tween-20) et 50 µL d’une dilution 1:2000 d’anticorps secondaire KAPPA LC-HRP de chèvre anti-humain (Thermo Fisher Scientific) ont été ajoutés aux puits, 50 µL d’une dilution 1:2000 D’anticorps secondaire IgG HC-HRP de chèvre anti-souris (Sigma #A0168) ont été ajoutés au puits témoin positif, les plaques ont été incubées pendant 2 min à température ambiante et lavées-étape ultra TMB-Elisa substrat (Thermo Fisher Scientific) par puits, incuber les plaques pendant 5 min à température ambiante, et arrêter la réaction de liaison AG:AB par addition de 50 µl 2 m H2SO4., L’absorbance a été mesurée à 450 nm à l’aide du système de détection multiple GloMax (Promega). Les tests ELISA pour tous les clonotypes ont été effectués en trois caractères, les valeurs ont été normalisées pour éliminer les signaux de fond et les erreurs ont été représentées sous forme d’écarts-types par rapport à la moyenne.
analyse de la formation d’amplicons chimériques au cours de la PCR imbriquée
quatre amplicons HC-LC définis ont été générés en amplifiant les HC et les LC à partir des plasmides pCMV respectifs (voir ci-dessus) et en utilisant une réaction D’assemblage par PCR pour générer les quatre assemblages HC-LC distincts., Les ADN plasmidiques HC et LC ont été utilisés comme modèles pour l’amplification par PCR des paires de chaînes clonales Top1, Top2, Top3 et Top4 à l’aide d’amorces spécifiques aux familles de gènes VH et VK respectives et aux régions constantes IgG et IgK (fichier supplémentaire 1: Tableau S2 et Figure S6a). De l’ADN plasmidique purifié (10 ng) a été ajouté à chaque réaction PCR de 25 µL contenant 0,4 µM de chaque amorce, un mélange dNTP de 200 µM, un tampon de réaction 1× Q5 et une ADN polymérase haute fidélité de 0,2 U/µL Q5., Le cycle thermique a été effectué avec dénaturation initiale à 98 °C pendant 3 min, suivie de 25 cycles de dénaturation à 98 °C pendant 30 s, recuit/extension à 71 °C pendant 1 min (pour L’ADN plasmidique HC) ou recuit à 64 °C pendant 1 min et extension à 72 °C pendant 1 min (pour L’ADN plasmidique LC), suivie d’une étape d’extension finale à 72 °C pendant 5 min. Les produits de PCR ont été chargés sur des gels séparés de TBE-agarose à 1% et séparés avec 100 V pendant 60 min. Les produits D’ADN souhaités de ~ 400 PB (pour HC) et ~ 350 PB (pour LC) ont été sélectionnés par taille et extraits du gel comme décrit ci-dessus., Les produits PCR purifiés de HC et de LC ont été utilisés comme modèles pour l’assemblage de HC et de LC par PCR d’extension de chevauchement (fichier supplémentaire 1: Figure S6b). Brièvement, 5 ng de chaque HC et de L’ADN LC apparié correspondant ont été ajoutés dans chaque réaction PCR de 50 µL contenant 1× tampon maître RT-PCR en 1 étape DART (Roboklon), 2× enzyme maître dART (Roboklon) et 0,4 µM de chaque amorce de région constante IgG et IgK (fichier supplémentaire 1: Tableau S2)., Le cycle thermique a été réalisée avec la RT inactivation à 95 °C pendant 3 min, suivie par trois cycles de dénaturation à 95 °C pendant 20 s, recuit à 56 °C pendant 30 s et d’extension à 72 °C pendant 2 min, suivie de 25 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 20 s, recuit à 56 °C pendant 30 s et d’extension à 72 °C pendant 4 min, suivie d’une extension finale de l’étape à 72 °C pendant 5 min. Les produits d’assemblage ont été chargés sur des gels de TBE-agarose à 1% et séparés avec 100 V pendant 45 min. Les produits d’assemblage de ~ 750 PB ont été sélectionnés par taille et extraits du gel d’agarose comme décrit ci-dessus., Les paires clonales HC-LC assemblées individuellement ont été regroupées et utilisées comme modèle pour l’amplification PCR imbriquée avec des amorces spécifiques aux régions constantes IgG et IgK (fichier supplémentaire 1: Tableau S2, Figure S6c). Les conditions de réaction par PCR imbriquée et de cycle thermique étaient les mêmes que celles décrites dans la section” amplification par PCR imbriquée des produits d’assemblage de cellules B humaines », sauf que l’amplification par PCR a été effectuée pendant 25 cycles. Les produits de PCR ont été chargés sur des gels de TBE-agarose à 1%, séparés avec 100 V pendant 60 min et les produits désirés de ~ 720 PB ont été extraits comme décrit ci-dessus., Les bibliothèques de séquençage des assemblages individuels et des assemblages mixtes après PCR imbriquée ont été préparées en suivant le guide de préparation des échantillons D’ADN Illumina TruSeq et 2 × 250 lectures d’extrémité appariée de base ont été générées à l’aide de la plate-forme Illumina MiSeq.