PCR è la tecnica dei moderni laboratori di biologia molecolare. Se è necessario copiare, sequenziare o quantificare il DNA , è necessario conoscere la PCR. In breve, la PCR (polymerase chain reaction) è una tecnica biochimica che utilizza il termociclaggio e gli enzimi per copiare il DNA in modo rapido e affidabile, ed è stata inventata in un lampo di ispirazione da uno scienziato che guida sulla Highway 128 da San Francisco a Mendocino.,
Questo articolo fornisce una breve panoramica di base della PCR, con alcuni suggerimenti per aiutarti a evitare le insidie più comuni. Se sei nuovo, o relativamente nuovo per PCR allora questo è per voi. (E anche se siete esperti in PCR vale la pena una lettura per aggiornare, e forse afferrare una punta o due!).
Ingredienti PCR di base:
Polimerasi
Le polimerasi sono enzimi che, nelle giuste condizioni, possono assemblare nuovi filamenti di DNA da DNA modello e nucleotidi. La reazione PCR originale era ingombrante perché le alte temperature necessarie per denaturare il DNA avrebbero ucciso le polimerasi., Ciò significava che dopo ogni ciclo di riscaldamento, nuove polimerasi dovevano essere aggiunte manualmente alla reazione – uno sforzo costoso. Tuttavia nella PCR moderna questo non è un problema, poiché le polimerasi utilizzate nella PCR moderna di solito provengono da una delle due fonti di batteri termofili, Thermus aquaticus o Pyrococcus furiosus. Queste polimerasi, rispettivamente, Taq (pronunciato “tack”) e Pfu (pronunciato “P-F-U”) resistono facilmente alle alte temperature associate a una reazione PCR., Le polimerasi Taq e Pfu commerciali sono progettate per la velocità, la fedeltà, la processività (capacità di completare letture lunghe) e la loro capacità di leggere i modelli GC rich. Le aziende escono costantemente con nuove polimerasi. Pertanto, non accontentarsi di “qualunque cosa sia nel tuo congelatore”, ma guardarsi intorno per la migliore polimerasi commerciale per le tue esigenze di PCR. Parla anche con il tuo rappresentante di vendita locale, poiché spesso possono distribuire campioni di polimerasi gratuiti, in modo da poter decidere cosa è meglio per te.
Template DNA
Questo è il DNA su cui progettate i primer., È il DNA che la tua polimerasi leggerà e copierà. Il DNA del modello può essere genomico, plasmidico o cDNA, ma qualunque sia la qualità della fonte conta. Il più intatto e più puro il vostro DNA modello più facile è quello di ottenere buoni risultati PCR. Inoltre, tieni presente che la quantità ideale di DNA dipenderà dalla tua fonte, di solito 1 pg – 1 ng di DNA plasmidico o 1 ng – 1 µg di DNA genomico per reazione PCR.
Primer
I primer sono brevi frammenti di DNA sintetizzato che si legano al DNA del modello. Dovrai progettare un primer” avanti “e un primer” inverso”., Il primer forward indica l’inizio della PCR. La sequenza di questo primer è la stessa della sequenza di DNA del modello 5-3. Il primer inverso designa la fine della PCR. La sequenza di questo primer è il complemento inverso del DNA del modello. In generale, i primer sono lunghi 18-22 coppie di basi. Tuttavia, più importante della loro lunghezza è la temperatura di fusione dei primer. La temperatura di fusione dei primer dovrebbe essere 54-60 ° C e il più simile possibile l’uno all’altro., Ci sono un sacco di calcolatrici online in grado di calcolare le temperature di ricottura primer, e la maggior parte delle aziende che sintetizzano primer forniscono tali calcolatrici.
Nucleotidi
Come monomeri del DNA, i nucleotidi sono necessari per fare copie del DNA. Per la maggior parte delle PCR del DNA userete i trifosfati del desossinucleoside (dNTPs). Puoi acquistarli separatamente o come mix dGTP, dCTP, dATP e dTTP. Qualunque cosa tu acquisti, tieni presente che i nucleotidi sono molto sensibili ai cicli di congelamento/disgelo. Pertanto è meglio creare sempre piccole aliquote dei tuoi DNTP., Assicurarsi inoltre di conservarli correttamente – non utilizzare un congelatore senza gelo che passa attraverso cicli di sbrinamento automatico.
Buffer
La maggior parte delle polimerasi commerciali viene fornita con il loro buffer ideale. Questi tamponi non solo forniscono il pH corretto, ma hanno sempre additivi come magnesio, potassio o DMSO, che aiutano a ottimizzare la denaturazione del DNA, la renaturazione e l’attività della polimerasi. Ci saranno più su questi additivi in un prossimo articolo.
Termociclaggio:
Questo è dove avviene la magia., Tutti gli ingredienti di cui sopra vengono aggiunti ad un tubo PCR e il tubo è termociclato. Al fine di ottenere il termociclaggio quando la PCR è stata inventata per la prima volta, i singoli tubi di PCR sono stati spostati manualmente tra bagni d’acqua riscaldati. (E pensi che il tuo lavoro in panchina sia noioso!) Ora, grazie all’invenzione di “Mr. Cycles”, la prima termociclatrice, la regolazione della temperatura viene ora eseguita automaticamente dai termociclatori. Il seguente è un tipico profilo termociclatore PCR:
Inizializzazione
In questa fase la reazione viene riscaldata a 94-96°C per 30 secondi a diversi minuti., Questo passaggio è di solito fatto solo una volta all’inizio della vostra reazione PCR. Questo passaggio è importante per attivare le polimerasi hot-start, se si utilizza una tale polimerasi, e per denaturare il DNA del modello. Tieni presente che se il contenuto GC del modello è elevato potrebbe essere necessario eseguire una fase di inizializzazione extra-lunga.
Denaturazione (ripetuta 15-40 volte)
In questa fase, la reazione viene riscaldata a 94-98°C per 15-30 secondi. Questo passaggio denatura il tuo DNA e i primer, che permetteranno loro di annealarsi l’un l’altro nel passaggio successivo.,
Ricottura (ripetuta 15-40 volte)
In questa fase, la temperatura della reazione viene rapidamente abbassata a 50-64°C per 20-40 secondi. La temperatura in questo passaggio deve essere abbastanza bassa che i primer denaturati possano formare coppie di basi Watson-Crick con il DNA del modello. Ma abbastanza alto che solo le strutture di DNA a doppio filamento più stabili (perfettamente accoppiate) possono formarsi. Di solito questa temperatura di ricottura perfetta è di alcuni gradi inferiore alla temperatura di fusione della coppia di primer. Anche durante questa fase la polimerasi si lega al complesso DNA primer / template., Anche se la polimerasi non inizierà a leggere fino a quando la temperatura non viene aumentata nel passaggio successivo.
Allungamento o estensione (ripetuto 15-40 volte)
In questo passaggio la reazione viene rapidamente riscaldata a 72-80°C. Questo è quando la polimerasi inizierà a leggere (nella direzione 5-3) e copiare il DNA del modello (nella direzione 3-5). La temperatura più elevata durante questa fase riduce le interazioni DNA primer/TEMPLATE non specifiche, aumentando così la specificità della reazione., Tuttavia, la temperatura esatta sarà determinata dalla preferenza della polimerasi, quindi leggi la tua confezione. La lunghezza di questo passaggio dipende da quanto tempo sarà la tua copia del DNA. In genere, la DNA polimerasi può copiare 1.000 coppie di basi al minuto. Pertanto è necessario consentire almeno 1 minuto di tempo di estensione per 1.000 basi. Alla fine di questa incubazione saranno stati creati nuovi pezzi di DNA a doppio filamento, costituiti sia da template che da nuovo DNA.
Passo 2-4 vengono poi ripetuti 15-40 volte
È vero che più cicli si programma più copie di DNA si creerà., Tuttavia, c’è un limite superiore. Ad un certo punto i nucleotidi liberi disponibili diventano limitanti e le copie di DNA troncate prematuramente possono diventare un problema. Quindi non essere avido con il tuo ciclismo. Meno ma un buon prodotto PCR pulito è preferibile a un sacco di prodotti sporchi.
Allungamento finale
Questo è un passaggio opzionale ma spesso consigliato. In questa fase la reazione viene mantenuta a 70-74 ° C per diversi minuti. (Di solito si utilizzerà la stessa temperatura utilizzata nella fase di allungamento o estensione.) Questo passaggio consente alle polimerasi di terminare la lettura di qualsiasi filo su cui si trovano attualmente., Questo passaggio opzionale può aiutare a ridurre il numero di copie troncate nel prodotto finale.
Attesa finale
La tua reazione è ora completa. Poiché l’intero processo può richiedere alcune ore, le reazioni PCR vengono spesso eseguite durante la notte o quando si è altrimenti allontanati; si consiglia di programmare il termociclatore per mantenere il prodotto PCR a 4°C fino al ritorno. Momento in cui è possibile analizzare o utilizzare il prodotto, o trasferirlo a più adatto stoccaggio a lungo termine come il vostro frigorifero.
Buona fortuna e Buona PCR-ing!
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