sequenziamento del gene 16S rRNA è comunemente utilizzato per l’identificazione, la classificazione e la quantificazione di microbi all’interno del complesso biologico miscele come campioni ambientali (ex marine water) e gut campioni (ex microbioma intestinale umano)., Il gene 16S rRNA è un componente altamente conservato del meccanismo trascrizionale di tutte le forme di vita basate sul DNA e quindi è altamente adatto come gene bersaglio per il sequenziamento del DNA in campioni contenenti fino a migliaia di specie diverse. I primer PCR universali possono essere progettati per indirizzare le regioni conservate di 16S rendendo possibile amplificare il gene in una vasta gamma di microrganismi diversi da un singolo campione. Convenientemente, il gene 16S rRNA è costituito da regioni sia conservate che variabili (Fig. 1)., Mentre la regione conservata rende possibile l’amplificazione universale, il sequenziamento delle regioni variabili consente la discriminazione tra specifici microrganismi diversi come batteri, archaea e eukarya microbica. L’identificazione del virus richiede metagenomica sequenziamento (il sequenziamento diretto del DNA totale estratto da una comunità microbica) a causa della loro mancanza di filogenetica del gene marcatore 16S.
figura 1 – a Circa 1,5 kb del gene 16S rRNA di E. coli che mostra le nove regioni variabili che rendono un bersaglio ideale come filogenetica del gene marcatore.,
Originariamente, gli studi su campioni ambientali richiedevano la coltivazione e l’isolamento delle specie per l’identificazione, un processo laborioso e dispendioso in termini di tempo. Tuttavia, l’accoppiamento della PCR rRNA 16S con il sequenziamento di nuova generazione ha permesso lo studio di molti campioni a basso costo. I primi studi di sequenziamento rRNA 16S hanno già trovato molte sequenze che non appartengono a nessuna specie coltivata nota, indicando che ci sono numerosi organismi non isolati e che i metodi basati sulla coltivazione trovano solo una piccola percentuale delle specie batteriche e archaeal in un campione., Inoltre, con la multiplazione di molti campioni e l’elevata profondità di copertura offerta dalle attuali piattaforme di nuova generazione, ora possiamo analizzare campioni da serie temporali complete per quantificare le dinamiche delle comunità microbiche in molti siti, o produrre mappe 3D dettagliate delle comunità microbiche, nonché esplorare se i cambiamenti nelle specie rare o abbondanti sono associati a salute e malattia.
Fig 2-clustering di 5 ‘e 3’ legge da diversi campioni ambientali mostrano che i campioni da un determinato tipo di ambiente cluster insieme bene.,
Le letture dal sequenziamento di nuova generazione possono essere fatte SALTARE contro database curati come il Ribosomal Database Project (RDP), GreenGenes e SILVA per l’identificazione e la classificazione. Le sequenze correlate sono” raggruppate ” e il numero di rappresentanti di ciascun cluster viene conteggiato. Gruppi di sequenze simili sono indicati come” unità tassonomiche operative ” (OTU). I conteggi OTU sono riassunti in una tabella di abbondanze relative per ciascun organismo in ciascun campione., Ad oggi, sono state sviluppate diverse pipeline di analisi per l’analisi dei dati di sequenza genica 16S rRNA e due pipeline comunemente utilizzate sono QIIME e Mothur. QIIME prende gli utenti dal loro output di sequenziamento grezzo attraverso analisi iniziali come OTU picking, assegnazione tassonomica e costruzione di alberi filogenetici da sequenze rappresentative di OTU e attraverso analisi statistiche a valle, visualizzazione e produzione di grafica di qualità di pubblicazione.,
LC Sciences offre un servizio completo di sequenziamento genico 16SrRNA per l’identificazione e la classificazione delle specie nei campioni microbici. Utilizziamo una strategia di amplificazione dei frammenti rDNA a doppia zona (amplified zones V3 + V4) 16S, sequenza sulla piattaforma Illumina MiSeq leader del settore e forniamo un’ampia analisi dei dati tra cui: statistiche di output dei dati di sequenziamento, cluster di sequenze in unità tassonomiche operative (OTU), analisi della diversità, classificazione delle specie e analisi dell’abbondanza.,
Recentemente, uno dei clienti di LC Sciences ha utilizzato il sequenziamento del gene 16S rRNA per studiare la propagazione microbica dell’aria in aree inquinate dove le condizioni meteorologiche avverse causano un doppio inquinamento di polvere e smog.