GLP-1 E SECREZIONE DI INSULINA
Panoramica della via sensibile all’ATP.
La secrezione di insulina stimolata dal glucosio (GSIS) è regolata da una serie di vie di segnalazione ioniche e non ioniche, note anche come vie KATP-dipendenti e indipendenti (34,35). Il meccanismo KATP-dipendente di accoppiamento stimolo-secrezione è rivisto in Fig. 1., In generale, la cellula β adatta la secrezione di insulina ai livelli di glucosio nel sangue prevalenti attraverso il metabolismo del glucosio. Quando i livelli di glucosio aumentano, aumenta il tasso di glicolisi, che genera substrati (principalmente piruvato) per il metabolismo ossidativo mitocondriale, il cui risultato è la generazione di ATP, o più correttamente un aumento del rapporto ATP-ADP (36). Questo evento fornisce il collegamento funzionale tra uno stimolo del glucosio e la secrezione di insulina., L’aumento di questo rapporto provoca la chiusura dei canali KATP delle cellule β, portando alla depolarizzazione della membrana plasmatica, all’attivazione dei canali Ca2+ voltaggio-dipendenti (VDCCs) e ad un aumento della concentrazione intracellulare di Ca2+ (i), il principale trigger per la secrezione di insulina. La ripolarizzazione delle cellule β è probabilmente mediata dai canali K+ (Kv) dipendenti dalla tensione e dai canali K+(KCa) sensibili alla tensione Ca2+ (37), che si aprono in risposta alla depolarizzazione della membrana indotta dal glucosio per ripristinare il flusso verso l’esterno di K+., GLP-1 è proposto per modulare GSI regolando l’attività di diversi canali ionici coinvolti nella secrezione di insulina KATP-dipendente, nonché passi distale alla modulazione del canale.
Canali KATP GLP-1 e β-cell.
Uno dei molti effetti cellulari osservati di GLP-1 è l’inibizione dei canali KATP delle cellule β (38-40). La depolarizzazione della membrana risultante indotta dalla chiusura del canale KATP avvia l’afflusso di Ca2 + attraverso i VDCC e innesca il rilascio esocitotico di insulina., La figura 2 mostra l’effetto eccitatorio del GLP-1 sul potenziale di membrana e il suo effetto inibitorio sia sulle correnti native del canale KATP dalle cellule INS-1 che sulle correnti mediate dai canali KATP ricombinanti (SUR1/Kir6.2) coespressi con il recettore GLP-1 in una linea cellulare di mammifero. Le conseguenze fisiologiche della chiusura del canale KATP GLP-1-facilitata sarebbero 1) aumentare l’eccitabilità delle cellule già al di sopra della soglia per il rilascio di insulina e 2) aumentare la percentuale di cellule β che secernono attivamente l’insulina a concentrazioni di glucosio normalmente sottosoglia per il rilascio di insulina.,
La visione del consenso è che l’effetto inibitorio di GLP-1 sui canali KATP è dipendente da cAMP / PKA (38-41), sebbene uno studio che utilizza le cellule β del ratto non sia d’accordo (42). Questa affermazione di Suga et al. (42) si basa sulla loro scoperta che lo specifico inibitore PKA Rp-cAMPS (100 µmol/l) non è stato in grado di prevenire la depolarizzazione cellulare e la riduzione della corrente KATP dell’intera cellula provocata da GLP-1. La completezza dell’inibizione della PKA da parte dei campi RP dovrebbe essere messa in discussione perché nello stesso studio, la forskolina ha indotto una significativa secrezione di insulina anche in presenza di campi Rp. In secondo luogo, Suga et al., suggeriscono che GLP-1 provoca un leggero aumento della sensibilità ATP del canale KATP tale che a basse concentrazioni micromolari di ATP, il canale KATP sarà più suscettibile alla chiusura. Tuttavia, nella normale cellula β pancreatica del ratto, sono presenti livelli millimolari di ATP (43), e a questi livelli fisiologici di ATP, probabilità aperta del canale KATP molto simile (Po) in assenza e presenza di GLP-1 sono previsti come segue. I nostri calcoli indicano che con un intracellulare di 2 mmol / l, il canale KATP Po è ridotto da 0,005 a 0,003 in presenza di GLP-1., È plausibile che uno spostamento verso sinistra della sensibilità ATP si verifichi in presenza di GLP-1. Tuttavia, l’entità osservata della riduzione della corrente KATP indotta da GLP-1 osservata nelle registrazioni patch-clamp a celle intere (Fig. 2) è probabilmente troppo grande per essere rappresentato esclusivamente dalle piccole diminuzioni di Po calcolate dai dati di Suga et al. (42). Recenti lavori del nostro laboratorio hanno dimostrato che l’inibitore PKA specifico permeante la membrana H-89 (44) è in grado di inibire completamente la riduzione della corrente KATP da parte di GLP-1 (45)., Inoltre, altri hanno mostrato risultati simili usando Rp-8-Br-cAMPS, un analogo più permeabile alla membrana di Rp-cAMPS (38,41). Le azioni di GLP-1 sui canali KATP possono anche coinvolgere altre vie di segnalazione perché l’inibizione del canale KATP da parte di GLP-1 nelle cellule β del topo è stata dimostrata dipendente dalla calmodulina, utilizzando gli inibitori della calmodulina W-7 e calmidazolium (46).
La dipendenza da glucosio delle azioni GLP-1 è stata ben stabilita, sebbene i meccanismi precisi per questa dipendenza non siano chiari (41,47)., Tuttavia, le azioni cellulari di PKA sul canale KATP possono fornire un collegamento tra questa chinasi e la sensibilità al glucosio di GLP-1. Altri gruppi hanno dimostrato che l’aggiunta della subunità catalitica di PKA (cPKA) a patch asportate contenenti canali KATP provoca un aumento della corrente KATP (39,48). Il nostro laboratorio ha recentemente dimostrato che l’effetto del cPKA sulla corrente KATP dipende dall’ADP (45). Quando i livelli di ADP sono elevati, cPKA aumenta la corrente del canale KATP in un sistema ricombinante, coerente con i risultati di Lin et al. (39)., Al contrario, poiché i livelli di ADP sono diminuiti, cPKA riduce la corrente KATP (45). Fisiologicamente, ciò può comportare un aumento trascurabile dell’eccitabilità delle cellule β quando i livelli di glucosio sono bassi (alti ), mentre quando i livelli di glucosio aumentano (bassi), la chiusura mediata da GLP-1 dei canali KATP, attraverso una via PKA-dipendente, porta alla depolarizzazione della membrana e ai successivi aumenti dell’eccitabilità delle cellule β., Particolare attenzione deve essere data al rapporto ATP-ADP cellulare quando si considera l’attività del canale KATP perché sono i cambiamenti in questo rapporto, più che semplicemente i cambiamenti intracellulari di per sé, che governano l’attività dei canali KATP nella cellula β intatta. L’ATP libero è altamente tamponato all’interno della cellula dalla membrana e dalle ATPasi citosoliche (43) e si prevede che non cambi significativamente con l’aumento del metabolismo del glucosio (36). Al contrario, la variazione reciproca dell’ADP, che non è tamponata nella stessa misura, è più significativa e si traduce in una variazione del rapporto ATP-ADP (36)., In effetti, l’importanza dell’ADP nel controllo dell’attività del canale KATP delle cellule β è stata dimostrata perché le mutazioni nella regione sensibile all’ADP del canale KATP umano portano alla secrezione incontrollata di insulina e all’ipoglicemia (49). L’identità molecolare dei siti di fosforilazione PKA è di notevole importanza ed è ancora in fase di studio. Sia il Kir6.,Le subunità 2 e SUR1 del canale KATP contengono sequenze target putative per la fosforilazione mediata da PKA (39,48) e la mutazione sistematica di questi residui dovrebbe chiarire i contributi relativi di questi siti all’azione di PKA sul canale KATP.
GLP-1, VDCCs e depositi intracellulari di Ca2+.
GLP-1 ha dimostrato di migliorare le correnti attraverso i VDCC nelle cellule β del topo, del ratto e dell’uomo (38,50-52), sebbene l’entità di questo effetto vari e spesso non raggiunga la significatività statistica., Nelle singole cellule β umane, GLP-1 ha dimostrato di aumentare l’attività VDCC di tipo L e l’ampiezza dei transienti intracellulari di calcio evocati dalla depolarizzazione, un effetto che ha rappresentato il 40% dell’aumento dell’esocitosi potenziata da GLP-1 (52). Sebbene i VDCC di tipo L siano classicamente considerati i principali regolatori dell’afflusso di Ca2+ che porta alla secrezione di insulina, le cellule β sono note per esprimere più isoforme del canale Ca2+ (53). Pereverzev et al. (54) ha riferito recentemente che i topi privi dell’isoforma a1E di Cav2.3 hanno ridotto la tolleranza al glucosio e diminuito le risposte insuliniche al glucosio., Ipotizzano che la regolazione della proteina G di questo canale possa modulare la secrezione di insulina in base alla regolazione del recettore muscarinico dell’acetilcolina dei VDCC in vitro (55).
Abbiamo trovato in cellule di insulinoma HIT-T15 trasfettate con il recettore GLP-1 che GLP-1 provoca un aumento delle correnti Ca2+ voltaggio-dipendenti (vedi 56 e Fig. 3 BIS). Ciò è dovuto, almeno in parte, a uno spostamento verso sinistra nella dipendenza da tensione dell’attivazione che ricorda l’effetto della fosforilazione VDCC da parte di PKA (57,58)., Abbiamo anche osservato uno spostamento verso destra nella dipendenza dalla tensione dell’inattivazione allo stato stazionario in modo tale che in presenza di GLP-1, meno canali sono stati effettivamente inattivati a un dato potenziale di tenuta (50). Questo è supportato da Britsch et al. (50), che suggeriscono che il trattamento con GLP-1 delle cellule β del topo rallenta l’inattivazione delle correnti Ca2+ voltaggio-dipendenti. Inoltre, GLP-1 ha portato ad un aumento del calcio intracellulare solo dopo l’aggiunta di glucosio, un effetto che è stato bloccato in parte dagli antagonisti VDCC (Fig. 3 QUATER)., La capacità di GLP-1 di migliorare le correnti Ca2+ è, come l’effetto sui canali KATP, dipendente dal campo (51,52), in base alla capacità dei campi Rp di prevenire un aumento delle correnti. In effetti, il trattamento delle cellule β del ratto con dibutirril cyclic-AMP, un analogo di CAMP permeabile alla membrana, ha replicato l’effetto del GLP-1 sulle correnti Ca2+ (51)., Inoltre, nei nostri studi (56), la risposta VDCC a GLP-1 è stata persa nelle cellule HIT-T15 che esprimono un recettore mutante GLP-1 privo di residui critici necessari per l’accoppiamento con l’adenilil ciclasi, mentre l’attività VDCC potrebbe ancora essere migliorata dall’agonista indipendente CAMP BAYK8644. Prove recenti suggeriscono che una proteina di ancoraggio A-chinasi (AKAP), AKAP18, si rivolge a PKA a VDCC e che questa chinasi può essere coinvolta nella modulazione GLP-1 di questi canali (59).,
Oltre agli effetti sui VDCC, GLP-1 può mobilitare i depositi intracellulari di calcio in modo dipendente dal campo (60,61), contribuendo eventualmente alla risposta oscillatoria i a GLP-1 osservata nelle cellule HIT-T15 (Fig. 3 QUATER) (62). I nostri studi suggeriscono che l’applicazione GLP-1 provoca oscillazioni in i nelle cellule HIT-T15 e che queste oscillazioni non vengono abolite (sebbene siano diminuite in ampiezza) mediante rimozione di Ca2+ extracellulare o blocco VDCC (Fig. 3 QUATER)., Infatti, in un certo numero di tipi di cellule, le oscillazioni Ca2+ indotte da un agonista sono principalmente causate dal rilascio di Ca2+ attraverso l’inositolo trisfosfato (IP3) e/o depositi sensibili alla ryanodina (63-65). Nelle cellule β, GLP-1 mobilita i depositi di Ca2 + in gran parte sensibilizzando il recettore della ryanodina (probabilmente l’isoforma di tipo 2, RYR-2) al processo di rilascio Ca2+indotto da Ca2+ (CICR) (61,66). Diversi studi hanno dimostrato che GLP-1 può aumentare i in modo indipendente da PKA (67-69)., Questo meccanismo è stato recentemente attribuito al CICR da depositi sensibili alla ryanodina tramite fattore di scambio nucleotidico guanina regolato da cAMP II (GEF-II o Epac2) e la sua interazione con la piccola proteina G Rap1 correlata a Ras o con l’effettore della piccola proteina G Rab3 Rim2 (68). L’importanza di cAMP-GEF-II-Rim2 è stata dimostrata, poiché l’inattivazione di questo complesso (mediante oligonucleotidi antisenso o costrutti mutanti) ha attenuato la risposta secretoria delle isole di topo o delle cellule di insulinoma MIN6 a GLP-1 (67)., Poiché l’affinità di cAMP per PKA è molto più alta (∼100 nmol/l) rispetto a cAMP-GEF-II (cAMP 10 mmol/l), è interessante ipotizzare che il percorso cAMP-GEF-II stimolato da GLP-1 possa operare su un aumento del campo locale piuttosto che sui cambiamenti globali., Sebbene la segnalazione del recettore GLP-1 stimoli la produzione di IP3 nelle cellule COS che esprimono il recettore GLP-1 (70), un ruolo per i depositi Ca2+ sensibili a IP3 in global i è in dubbio perché la produzione IP3 stimolata da GLP-1 nelle cellule β primarie è riferito minima (71,72) e l’antagonista del recettore IP3 xestospongin C non è riuscito a bloccare Tuttavia, il rilascio di Ca2 + regolato da IP3 dai granuli di insulina è stato suggerito dagli studi di Nakagaki et al., (62), che suggeriscono che GLP-1 può regolare in modo univoco il rilascio temporale e spaziale di calcio intracellulare attraverso la segnalazione IP3 locale. Pertanto, il rilascio mediato da GLP-1 delle riserve intracellulari, insieme al potenziamento dell’ingresso di Ca2+ attraverso VDCC, probabilmente contribuisce all’effetto insulinotropico di GLP-1.
Canali GLP-1 e β-cell Kv.
Le correnti K+ voltaggio-dipendenti, come quelle mediate dai canali Kv o KCa, mediano la ripolarizzazione delle cellule β dopo uno stimolo depolarizzante, come il glucosio (37)., Recentemente, abbiamo riferito che i canali della famiglia Kv1 e Kv2 regolano la secrezione di insulina, perché knockout funzionale dominante-negativo di una di queste famiglie di canali maggiore GSIS (73). I canali Kv2.1 mediano la maggior parte di questo effetto (>60%), il cui meccanismo comporta una maggiore depolarizzazione della membrana stimolata dal glucosio e l’ingresso di Ca2+ (osservazioni inedite). Poiché le correnti Kv delle cellule β sono potenti regolatori glucosio-dipendenti della secrezione di insulina, abbiamo ipotizzato che i secretagoghi fisiologici, come GLP-1, possano regolare la funzione del canale Kv., In effetti, riportiamo altrove in questo supplemento che l’agonista del recettore GLP-1 exendin 4 inibisce le correnti K + esterne dipendenti dalla tensione nelle cellule β del ratto serrate nella configurazione dell’intera cellula del 40% e prolunga significativamente il corso temporale della ripolarizzazione delle cellule β dopo la depolarizzazione transitoria mediante iniezione di corrente. Ciò si confronta con una riduzione dell ‘ 86% delle correnti K+ verso l’esterno ottenuta con il tetraetilammonio antagonista del canale Kv generale. GLP-1 antagonizzato tensione-dipendente verso l’esterno K+ correnti in ratto β-cellule in assenza di glucosio., Tuttavia, questo effetto può ancora contribuire alla dipendenza da glucosio dell’effetto insulinotropico di GLP-1, poiché i canali Kv non dovrebbero normalmente essere attivi fino a dopo una depolarizzazione indotta dal glucosio della membrana cellulare (37). Inoltre, e simile all’effetto di GLP-1 sugli altri canali ionici menzionati sopra, l’inibizione mediata da exendin 4 dei canali Kv delle cellule β dipende dalla segnalazione di cAMP. Uno studio recente, tuttavia, ha suggerito che la segnalazione cAMP non era sufficiente di per sé per antagonizzare le correnti K+ dipendenti dalla tensione in una linea cellulare che secerne insulina (INS-1) (74).,
Numerosi studi hanno descritto gli effetti delle alterazioni ormono-mediate nelle correnti K+ voltaggio-dipendenti, sia eccitatorie che inibitorie. La migliore caratteristica di questi effetti è la downregolazione della corrente K+ tensione-dipendente nei linfociti e upregulation nei miociti cardiaci (75,76). In entrambi questi tessuti, la via di segnalazione cAMP/PKA è stata implicata nella regolazione di questi canali (76,77)., I rapporti suggeriscono che cAMP può ridurre le correnti K + voltaggio-dipendenti nei linfociti murini (76) e una linea cellulare pituitaria (78) ma migliorare le correnti K+ voltaggio-dipendenti nei miociti cardiaci (77), una scoperta che è stata confermata a livello a canale singolo nei miociti atriali rana (79) e nell’assone calamaro gigante (80)., La fosforilazione può avvenire direttamente sul canale, poiché la fosforilazione PKA di un canale Kv atriale vicino all’attività del canale potenziata NH2-terminus (81) e la fosforilazione delle subunità α del canale Kv1 regola l’entità dell’inibizione di questi canali conferita da una subunità β regolatrice (82). La fosforilazione delle subunità β può anche modulare l’interazione regolatrice con le subunità α che formano pori (83). Recentemente è stato dimostrato che la regolazione di un canale Kv cardiaco (KvLQT) da parte di cAMP richiede l’espressione di AKAP15/18 o AKAP79 (84)., Inoltre, un aumento della corrente K+ voltaggio-dipendente è implicato nell’inibizione indotta dall’epinefrina dell’aumento glucosio-dipendente in i in ob/ob e +/+ cellule β di topo (85) poiché l’effetto è stato invertito dal tetraetilammonio. È interessante notare che l’effetto inibitorio dell’epinefrina su i è stato anche invertito dall’attivatore di adenilil ciclasi forskolin (85). Pertanto, crediamo che ci siano prove crescenti che suggeriscono che la modulazione ormonale delle correnti Kv è fisiologicamente importante. In particolare, l’inibizione GLP-1 di queste correnti dovrebbe portare ad una maggiore eccitabilità delle cellule β.,
GLP-1 e altri canali ionici a cellule β.
Gli aumenti del campo intracellulare sono noti da tempo per migliorare le correnti Na+ (86), un effetto che può essere mediato attraverso la fosforilazione diretta del canale da parte di PKA (87). Una risposta di corrente Na + transitoria al cAMP è stata descritta per la prima volta nei neuroni gasteropodi e definita INA(cAMP) (88)., Nelle cellule che secernono insulina, l’espressione di RNA dei geni cationici non selettivi mSTRPC4 e LTRPC2 è stata recentemente rilevata nelle cellule di insulinoma e nelle isole umane, rispettivamente (89), e cAMP è stato segnalato per indurre l’espressione genica di mNSC1, che codifica un canale cationico non specifico del topo (NSCC) (90). Si pensa che GLP-1 migliori un NSCC che trasporta prevalentemente correnti Na+ (91,92). Questo effetto si verifica attraverso l’attivazione di GLP-1 della segnalazione cAMP e il rilascio di depositi intracellulari di Ca2+ e può servire come un altro importante percorso modulatorio per GLP-1 nella cellula β (40)., Non è chiaro se gli NSCC attivati da GLP-1 corrispondano alla corrente cationica non selettiva prodotta dall’attivazione del recettore Ca2+-sensing (93), ma quest’ultimo effetto non coinvolge l’attivazione della subunità Gs e potrebbe quindi non coinvolgere la via cAMP/PKA.
Gli effetti del GLP-1 su altri canali ionici sono poco conosciuti. Le correnti Cl attivate dal gonfiore cellulare sono state rilevate nelle cellule secernenti insulina (94), ma un ruolo per questi canali nella secrezione di insulina non è chiaro., I canali Cl come il regolatore di conduttanza transmembrana della fibrosi cistica e i canali Cl rettificanti verso l’esterno sono attivati dalla segnalazione cAMP/PKA (95). Se si verificano nella cellula β, questo effetto tenderebbe a promuovere la depolarizzazione. Un rapporto suggerisce che GLP-1 attiva una corrente Cl sensibile a Ca2+negli ovociti di Xenopus che esprimono il recettore GLP− 1 (96), un effetto che dipendeva dalla mobilizzazione intracellulare Ca2+ P3(1,4,5) (96). Resta da determinare, tuttavia, se GLP− 1 può stimolare le correnti Cl nelle cellule che secernono insulina.
GLP-1 ed esocitosi.,
Il glucosio può esercitare un effetto stimolante sull’esocitosi dell’insulina, indipendentemente dalle sue azioni ben caratterizzate avviate dall’inibizione dei canali KATP. L’importanza di questo percorso può in parte essere realizzata dal fatto che i topi con un’interruzione mirata in KATP (Kir 6.2 o SUR1) non mostrano anomalie evidenti nella tolleranza al glucosio (97,98). La secrezione di insulina indipendente da KATP non è ben compresa e si pensa che coinvolga diversi segnali che agiscono su bersagli non ionici, in particolare le fasi distali dell’esocitosi., È stato proposto che il metabolismo del glucosio è richiesto per questo effetto stimolante e che i segnali probabili includono ATP, cAMP, glutammato e malonyl-CoA (rev. in 99 e 100). Dato che ATP, cAMP e PKA sono tutti implicati nel processo esocitotico, è plausibile pensare che GLP-1 possa avere effetti distali rispetto alle azioni sui canali ionici, aumentando ulteriormente la secrezione di insulina. È noto che le azioni che sopprimono l’accumulo di CAMP indotto da GLP-1 e l’attivazione di PKA inibiscono la secrezione di insulina, suggerendo che cAMP e/o PKA sono gli effettori plausibili (101)., Nelle cellule β di topo, solo una frazione di esocitosi può essere rappresentata da azioni sull’accoppiamento stimolo-secrezione (102). Da studi che dimostrano che cAMP induce secrezione in presenza di i basso e alto, si suggerisce che cAMP sensibilizzi il macchinario esocitotico. Studi che utilizzano inibitori fotoreleasable cAMP e PKA dimostrano che cAMP evoca effetti PKA-dipendenti e indipendenti sull’esocitosi. Gli aumenti di cAMP, indipendentemente dall’attivazione di PKA, sembrano accelerare l’esocitosi del pool facilmente rilasciabile nelle cellule β (103)., La mobilizzazione PKA-dipendente dei granuli secretori, a differenza della generazione di cAMP stesso, sembra richiedere il metabolismo del glucosio (aumento di ATP/ADP) e comporta la traslocazione dei granuli (103.104). Tale effetto aumenterebbe la dimensione della piscina facilmente rilasciabile, aumentare il tasso di rifornimento della piscina e migliorare l’esocitosi. Poiché GLP-1 può aumentare sia cAMP che PKA, gli effetti sull’esocitosi possono essere implicati da questi dati., Ci sono parecchie proteine potenziali dell’obiettivo per le azioni di GLP-1, compreso le proteine solubili (RULLANTE) del ricevitore della proteina dell’attaccamento di fattore sensibile di N-ethylmaleimide delle cellule β (105).
GLP – 1 e omeostasi dell’energia intracellulare.
Recenti studi sulle cellule β clonali suggeriscono che le azioni insulinotropiche del GLP-1 sono in parte mediate da una stimolazione PKA-dipendente della lipasi ormono-sensibile (HSL) (106). Si propone che le azioni lipolitiche di GLP-1 causino la rottura dei trigiceridi per liberare gli acidi grassi nelle cellule β, che vengono poi convertiti in CoA a catena lunga., Un aumento degli acidi grassi liberi potrebbe quindi fornire il substrato per l’ossidazione mitocondriale e la produzione di ATP, portando ad un maggiore aumento del rapporto ATP-ADP intracellulare e ad un’ulteriore inibizione dei canali KATP. Inoltre, poiché l’ATP può influenzare l’esocitosi, alcune delle azioni di GLP-1 possono essere mirate ai passaggi distali dell’esocitosi, come menzionato sopra. È stato dimostrato in diversi studi che l’ATP facilita marcatamente l’esocitosi indipendente dalla depolarizzazione cellulare ma dipende da Ca2+ (99)., Quindi, un altro potenziale meccanismo potrebbe spiegare la secrezione di insulina indotta da GLP-1.