Rilevamento di Pneumocystis jiroveci in Campioni Respiratori da Quattro Metodi di Colorazione

Pneumocystis jiroveci, precedentemente noto come Pneumocystis carinii, rimane un’importante causa di polmonite nei pazienti immunocompromessi, sebbene le infezioni con questo agente siano diminuite dopo l’uso diffuso della terapia antiretrovirale altamente attiva (HAART) per l’infezione da virus dell’immunodeficienza umana (HIV) (9, 12). I pazienti immunocompromessi per ragioni diverse dall’infezione da HIV sono anche a rischio di polmonite causata da P., jiroveci, compresi i pazienti con neoplasie ematologiche e coloro che hanno ricevuto agenti immunosoppressori per il trattamento di malattie autoimmuni (2, 11, 12).

Sebbene una varietà di test di amplificazione degli acidi nucleici, compresi i test PCR in tempo reale, siano stati sviluppati per la rilevazione di P. jiroveci, questi test non sono comuni nella maggior parte dei laboratori di microbiologia clinica e non sono disponibili in commercio (3, 5). Pertanto, il principale metodo di laboratorio per la rilevazione di P., jiroveci, un organismo che non può essere coltivato con metodi standard, è l’esame visivo diretto del campione clinico dopo un certo tipo di metodo di colorazione (12). Una varietà di macchie istochimiche sono state utilizzate per rilevare Pneumocystis in campioni clinici. Queste macchie istochimiche includono le macchie Diff-Quik, Grocott-Gomori methenamine silver (GMS) e Calcofluor white. Diff-Quik stain è una modifica di Wright stain (3). La macchia GMS è una macchia di precipitazione d’argento comunemente usata per visualizzare i funghi nelle sezioni istologiche (10)., La macchia bianca di calcofluor è una macchia fluorescente, il cui principio attivo è il cellufluor, che si lega in modo non specifico ai polisaccaridi beta-collegati, come la chitina e la cellulosa, e viene utilizzato per la visualizzazione diretta dei funghi in campioni clinici (4). Le macchie immunofluorescenti, che impiegano anticorpi diretti contro P. jiroveci, sono disponibili anche per la rilevazione diretta di questo organismo in campioni clinici (3, 5). Queste macchie sono simili alle macchie immunofluorescenti dirette e indirette utilizzate per la rilevazione di virus in campioni clinici., Ogni macchia ha i suoi sostenitori; i dati comparativi nell’era HAART sono limitati.

Pertanto, abbiamo eseguito una valutazione multi-istituzionale di quattro metodi di colorazione comunemente utilizzati per la rilevazione diretta di P. jiroveci in campioni respiratori clinici. I vetrini di campioni respiratori studiati, la maggior parte dei quali erano campioni di lavaggio broncoalveolare, sono stati preparati utilizzando la citocentrifugazione. Gli strisci replicati di 313 campioni respiratori presentati per l’esame di P. jiroveci sono stati esaminati per la presenza di P. jiroveci con il bianco di Calcofluor (Fungifluor; Polysciences, Inc.,, Warington, Papà.), GMS, Diff-Quik (Baxter Scientific, McGraw Park, Ill.), e Merifluor Pneumocystis (Meridian Bioscience, Inc., Cincinnati, Ohio) macchie. I vetrini sono stati macchiati con le macchie Merifluor Pneumocystis e Diff-Quik secondo le istruzioni del produttore. Per la colorazione bianca a base di calcofluor, è stata aggiunta 1 goccia di Fungifluor a ciascun vetrino, il coprioggetto è stato applicato in modo che il reagente coprisse l’intera area contenente il campione e il vetrino è stato lasciato riposare per almeno 10 minuti in una camera di umidità scura a temperatura ambiente prima dell’interpretazione con un microscopio a fluorescenza., Per la colorazione GMS, i vetrini sono stati sottoposti a microonde per 40 s in una soluzione di acido cromico al 10%, lavati con acqua e quindi eliminati con metabisolfito di sodio all ‘ 1% per 30 s. Dopo che i vetrini sono stati lavati con acqua distillata, sono stati posti in un barattolo di coplin contenente 50,0 ml di soluzione di lavoro, I vetrini sono stati nuovamente risciacquati con acqua distillata, trattati con 1% di cloruro d’oro per 2-5 s, risciacquati con acqua distillata, esposti al 5% di tiosolfato di sodio per 1 min, contrastati con una soluzione di lavoro verde chiaro, eliminati in xilene, coperti con vetrini di copertura ed esaminati mediante microscopia ottica di routine.

Ciascuno dei laboratori delle quattro istituzioni partecipanti ha eseguito una delle diverse macchie e reso le loro interpretazioni basate su tale metodo di colorazione., Gli individui di ogni istituzione avevano esperienza con il metodo di colorazione eseguito lì e l’interpretazione della macchia. Ai campioni sono stati assegnati codici di identificazione univoci e ogni macchia è stata esaminata in modo indipendente, senza conoscere il risultato ottenuto con un altro metodo di colorazione sullo stesso campione., La quantità di campione era raramente insufficiente per realizzare tutti e quattro i vetrini; 308 vetrini erano disponibili per la colorazione con Calcofluor white, 310 vetrini erano disponibili per la colorazione con Merifluor Pneumocystis, 307 vetrini erano disponibili per la colorazione con Diff-Quik e 310 vetrini erano disponibili per la colorazione con GMS. In nessuno dei casi in cui una diapositiva non era disponibile a causa di una quantità insufficiente di campione, la categorizzazione di quel campione come vero positivo o vero negativo (vedi sotto) dipende dal risultato della diapositiva assente.,

La sensibilità, la specificità e i valori predittivi positivi e negativi sono stati calcolati con metodi standard (Tabella 1). La proporzione di veri positivi e falsi positivi risultati per le coppie di test sono stati confrontati con il test chi-quadrato utilizzando il EpiCalc 2000 software statistici (www.brixtonhealth.com/epicalc.html).

anche se più veri campioni positivi sono stati rilevati dal Merifluor Pneumocystis macchia, questo numero non era significativamente diversi da quelli rilevati dal Calcofluor white (P = 0.260) e GMS (P = 0.343) macchie., Allo stesso modo, il numero di veri positivi rilevati da GMS e macchie bianche di calcofluoro non era significativamente diverso (P = 0,838) l’uno dall’altro. Il numero di veri positivi rilevati dalla macchia Diff-Quik, tuttavia, era significativamente inferiore a quelli rilevati dalle macchie Merifluor Pneumocystis (P = 0,002), GMS (P = 0,027) e Calcofluor white (P = 0,042). Il numero di falsi positivi non era significativamente diverso tra le macchie Calcofluor white, GMS e Diff-Quik (ogni confronto aveva un valore P di >0.05)., Il numero di falsi positivi riportati dopo la colorazione con Merifluor Pneumocystis stain, tuttavia, è stato significativamente maggiore di quelli riportati dopo la colorazione con GMS (P = 0,004), Calcofluor white (P = 0,001) o Diff-Quik (P = 0,001).

In alcuni casi, un campione di espettorato indotto può essere il primo campione ricevuto per la valutazione della presenza di Pneumocystis nel workup diagnostico di un paziente con polmonite sospettata di essere causata da questo organismo (6)., Se un campione di espettorato indotto non riesce a produrre l’agente eziologico della polmonite, allora un campione di lavaggio broncoalveolare, che è significativamente più costoso e comporta un piccolo rischio per il paziente, può essere necessario per ottenere materiale diagnostico., A causa delle differenze nel trattamento della polmonite causata da Pneumocystis rispetto alla polmonite causata da altri microrganismi e della possibile necessità di broncoscopia, che comporta costi e rischi aggiuntivi per il paziente, nel caso in cui non venga stabilita una diagnosi, è importante utilizzare il miglior metodo di colorazione possibile per la rilevazione di questo organismo.,

Inoltre, l’importanza di un metodo di colorazione sensibile e specifico nell’era di HAART è particolarmente importante, poiché la minore prevalenza di polmonite causata da Pneumocystis influisce negativamente sul valore predittivo positivo di qualsiasi saggio che abbia una specificità inferiore al 100% (9). Sebbene la prevalenza della polmonite causata da Pneumocystis sia diversa nell’era HAART rispetto all’era pre-HAART, la scelta del metodo di colorazione ottimale per la rilevazione di Pneumocystis è importante anche per i pazienti con altre condizioni immunocompromesse che sono a rischio di infezione., In effetti, la scelta del metodo di colorazione ottimale può essere più importante per la rilevazione di Pneumocystis nei pazienti immunocompromessi non infetti da HIV, poiché è stato dimostrato che i campioni respiratori di questi pazienti hanno un carico inferiore di organismi rispetto a quelli dei pazienti immunocompromessi infetti da HIV (6).

Nella nostra esperienza, la macchia Diff-Quik non era un mezzo efficace di screening per la presenza di P. jiroveci (cioè un metodo di colorazione primario) a causa della bassa sensibilità e del valore predittivo negativo di questa macchia. Significativamente più esemplari che contenevano P., jiroveci sono stati persi con il metodo Diff-Quik rispetto a Calcofluor white, Merifluor Pneumocystis e GMS. Raab et al. descrivere anche sia una bassa sensibilità (68%) che una bassa specificità (88%) quando la macchia Diff-Quik da sola è stata utilizzata per la rilevazione di Pneumocystis e altri funghi in campioni di lavaggio broncoalveolare (10). Questi risultati, tuttavia, sono in contrasto con quelli di altri gruppi, che hanno riferito che il metodo Diff-Quik era paragonabile al metodo di colorazione GMS per la rilevazione di Pneumocystis (7, 8)., Un gruppo ha riferito che il metodo Diff-Quik era più sensibile del bianco di Calcofluor, della colorazione immunofluorescente diretta e persino della PCR, ma questi risultati non sono stati corroborati (1).

Al contrario, la macchia di Merifluor Pneumocystis era il metodo di colorazione più sensibile e può rivelarsi utile come schermo per escludere la presenza di Pneumocystis, ma era il metodo meno specifico in questo studio. Tuttavia, il numero di risultati falsi positivi con la macchia di Merifluor Pneumocystis è stato significativamente maggiore di quello riportato per ciascuna delle altre macchie., La macchia di Merifluor Pneumocystis aveva un valore predittivo positivo solo dell ‘ 81,9%, rispetto agli altri tre metodi, tutti con valori predittivi positivi superiori al 96%. Ng et al. hanno anche descritto risultati apparenti falsi positivi con questo metodo di colorazione (8). Pertanto, suggeriamo che se Merifluor Pneumocystis viene utilizzato come metodo di colorazione primario in un laboratorio di microbiologia clinica, deve essere eseguita la conferma con un secondo metodo per aumentare la specificità e il valore predittivo positivo del risultato finale del test.,

Le sensibilità delle macchie Calcofluor white e GMS erano intermedie tra quelle delle macchie Diff-Quik e Merifluor Pneumocystis, ma erano altamente specifiche e avevano valori predittivi positivi superiori al 96% e valori predittivi negativi superiori al 93%. Fraire et al. hanno anche descritto le macchie Calcofluor white e GMS come comparabili per il rilevamento di Pneumocystis, con concordanza del 92,6% (4). Baughman et al., (1a) descrivono anche la sensibilità di una macchia anticorpale immunofluorescente indiretta diretta verso Pneumocystis e superiore nella sensibilità rispetto a una macchia Wright modificata e una macchia GMS, ma hanno riportato un singolo risultato falso positivo e quindi una specificità molto più alta di quella che descriviamo. È possibile che con una pratica aggiuntiva, si possano riconoscere più facilmente le forme patognomoniche con la macchia Diff-Quik, aumentando così la sensibilità di tale saggio., Allo stesso modo, forse con ulteriore esperienza con la macchia di Merifluor Pneumocystis, si potrebbe imparare a discriminare meglio tra colorazione vero-positiva e falsa-positiva e quindi diminuire il numero di risultati falsi positivi.

Nella nostra esperienza, le macchie Calcofluor white e GMS hanno i migliori parametri per l’uso di routine in un laboratorio clinico. Sebbene questi saggi fossero meno sensibili del saggio immunofluorescente, erano altamente specifici e avevano valori predittivi positivi e negativi più che accettabili.,

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