“Il sequenziamento dell’RNA è un metodo di sequenziamento di nuova generazione ad alto throughput utilizzato per analizzare l’espressione genica e gli studi di trascrittomica.”
L’acido ribonucleico è un tipo di acido nucleico coinvolto principalmente nell’espressione genica, nella regolazione genica e nella codifica/decodifica delle informazioni.
mRNA – RNA messaggero è una sequenza codificante di un gene implicato nella sintesi di proteine, circa il 4% del pool di RNA è costituito da mRNA mentre il resto sono RNA non codificanti.,
Sebbene circa il 90% degli RNA non siano codificanti, questi sono importanti per l’esecuzione di varie funzioni.
Ad esempio,
- tRNA – trasferisce l’amminoacido al sito ribosomiale, mentre la traduzione.
- rRNA – l’RNA ribosomiale aiuta nella traduzione.
- microRNA – espressione genica e regolazione dell’espressione genica.
- siRNA-protegge una cellula dagli RNA esogeni.
Un mRNA è un acido nucleico a filamento singolo trascritto da un gene e da cui la proteina viene tradotta.,
L’mRNA o trascrizione contiene solo le sequenze codificanti di un gene. Così possiede soltanto le sequenze che sono richieste nella formazione della proteina.
D’ora in poi, analizzando un mRNA, è possibile determinare il modello di espressione del gene correlato.
Inoltre, l’esame totale dell’RNA ci dà un’idea di quali geni sono collegati alla formazione di proteine e quali no.
Significa che la quantità di RNA totale, mRNA e ncRNA può essere determinata studiando l’RNA totale.,
La trascrittomica è lo studio dell’intero mRNA – spesso chiamato come trascrittomi o RNA totale presente in una cellula o popolazione cellulare.
Analizzando il trascrittoma di una cellula, è possibile esaminare l’intero pool dell’espressione genica. Una delle tecniche importanti utilizzate negli studi di trascrittomica è il sequenziamento dell’RNA.
Il trascrittoma di un organismo è più grande, complesso e più incerto, a differenza del genoma.
Il trascrittoma varia in condizioni diverse e in un ambiente diverso., Stile di vita, dieta, esercizio fisico, ambiente, condizioni e altri fattori esterni svolgono un ruolo significativo nella regolazione del trascrittoma.
Qui nel sequenziamento dell’RNA, il cDNA sintetizzato dall’mRNA viene sequenziato e quantificato in un sequencer. Nel presente articolo, discuteremo solo il sequenziamento dell’RNA, ma prima di questo leggi il nostro precedente articolo sulla trascrittomica: Cos’è la trascrittomica?,
Argomenti chiave:
Principio del sequenziamento dell’RNA:
Il sequenziamento dell’RNA è un metodo di sequenziamento e quantificazione dell’RNA ad alta velocità di nuova generazione utilizzato per studiare la trascrittomica e l’espressione genica.
Un cDNA è costruito da mRNA totale attraverso il processo di trascrizione inversa e frammentato. Simultanea, legatura adattatore e preparazione libreria sono praticati prima di fare sequenziamento.
Il sequencer legge e quantifica il cDNA complementare all’mRNA.,
Steps in RNA-seq:
- RNA isolation
- cDNA synthesis
- Adaptor ligation
- Library preparation
- DNA fragmentation
- Sequencing
- Downstream applications
RNA isolation:
The first step in the RNA sequencing is the isolation of total RNA, mRNA or ncRNA for the experiment.,
Isolare l’RNA è un processo noioso rispetto all’isolamento del DNA. L’RNA può essere ripartizione facilmente. Inoltre, la possibilità di contaminazione è elevata nell’isolamento dell’RNA.
Quindi è necessario prestare particolare attenzione durante l’isolamento dell’RNA e la mano esperta necessaria per farlo.
L’RNA puro ad alto rendimento è necessario per il sequenziamento dell’RNA.
La purezza e la quantità dell’RNA sono misurate usando il Nanodrop o il qubit.
Note: for isolating mRNA from the total RNA pool, one additional step is required, using the oligo dT specific column in the purification or final step of elution, total mRNA can be isolated from the rest of RNAs.
Ora il nostro campione di RNA è pronto per il passo successivo.,
Reverse transcriptase PCR:
Un altro innovativo set up per il sequenziamento dell’RNA è quello di fare reverse transcriptase PCR in cui l’RNA è inverso trascritto in DNA.
Utilizzando uno speciale tipo di polimerasi nota come DNA trascrittasi inversa, il cDNA viene sintetizzato dall’mRNA.
Per saperne di più su RT PCR qui: Reverse transcriptase PCR.
Sintesi del cDNA del secondo filamento:
Dopo che il cDNA è stato sintetizzato a partire dall’mRNA, è necessaria la sintesi del DNA del secondo filamento. Per questo, la PCR viene eseguita utilizzando la normale Taq DNA polimerasi nella PCR convenzionale.,
La polimerasi aggiunge DNTP al filamento di DNA in crescita utilizzando il set di primer.
Preparazione della libreria:
Il primo passo nella preparazione della libreria o preparazione della libreria NGS inizia con le frammentazioni.
Utilizzando il tipo speciale di endonucleasi restrizione intero set di ds cDNA è frammentato per il NGS.
Nota:
La preparazione della libreria varia da piattaforma a piattaforma come alcuni frammenti mRNA prima di eseguire la trascrittasi inversa mentre alcuni lo eseguono più tardi dopo la preparazione del cDNA.,
Nell’ultimo passaggio della preparazione della libreria, le estremità vengono legate con le sequenze dell’adattatore e amplificate per la riparazione delle estremità. Il da-tailing è facoltativo in caso di libreria mRNA.
Purificazione della libreria:
L’intera libreria viene purificata utilizzando il kit di purificazione del DNA pronto all’uso.
Nell’ultimo passaggio, è molto cruciale purificare l’intera libreria di frammenti per cui la concentrazione della libreria viene valutata utilizzando la PCR quantitativa o il bioanalyzer.,
Nota:
Per un principiante penso che la preparazione della biblioteca e la frammentazione del DNA siano molto difficili da capire, quindi pensiamo che dovremmo scrivere un intero articolo sulla frammentazione del DNA genomico, la preparazione della biblioteca e la sua importanza in NGS.
Comunque andiamo avanti,
Nel passaggio successivo, il campione di DNA frammentato viene inviato per il sequenziamento.
Sequenziamento del DNA:
Ora il campione viene sequenziato nella macchina NGS high throughput che legge la sequenza e quantifica anche l’acido nucleico.,
La chimica alla base del sequenziamento del cDNA dipende da quali piattaforme stiamo usando, anche se il metodo ampiamente utilizzato è l’uso della chimica della fluorescenza.
Nel sequencer, i singoli frammenti vengono “letti” separatamente e sequenziati. I dati finali vengono inviati al laboratorio di bioinformatica per l’analisi post-sequenziamento.,
Different types of RNA and its function:
| Abbreviation | RNA types | Function |
| mRNA | Messenger RNA | Codes for protein |
| tRNA | Transfer RNA | Transfer amino acid to the site of translation., |
| rRNA | Ribosomal RNA | Catalyse the translation reaction |
| miRNA | microRNA | Gene regulation |
| siRNA | Smaller interfering RNA | Gene regulation and maintaining gene expression. |
| LncRNA | Long non-coding RNA | Transcriptional regulation and epigenetic regulations., |
| snRNA | Small nuclear RNA | Helps in mRNA splicing and related functions |
| snoRNA | Small nucleolar RNA | Helps in RNA nucleotide modification |
| piRNA | Piwi-intercalating RNA | Function in defence against transposon; transposon defence system. |
| scaRNA | Small Cajal body-specific RNA | Also helps in nucleotide modifications (a type of snoRNA)., |
| shRNA | Small hairpin RNA | La molecola di RNA sintetico aiuta nella regolazione genica e nel controllo dell’espressione genica. |
Analisi dei dati transcriptome:
Uno dei lavori noiosi, come abbiamo già discusso nel precedente articolo è l’analisi dei dati transcriptome e l’interpretazione dei risultati. I dati NGS sono enormi e più complessi.,
Francamente parlando, l’insegnamento analisi dei dati di trascrittomica non è possibile, si dovrebbe avere a prendere pratica hands-on per imparare, ancora, cercherò di insegnare ciò che è prossimo in questo processo.
Diversi frammenti vengono sequenziati nella macchina e vengono raccolti i dati. Nella fase successiva, in base alla regione di fiancheggiamento dei frammenti, vengono disposti i cosiddetti “contings” per ottenere varianti di giunzione.
Nella fase successiva, il trascrittoma viene confrontato con la sequenza di riferimento o può essere assemblato de novo.,
Una breve panoramica dell’intero processo di RNA-seq.
Sequenziamento del trascrittoma intero:
L’intero trascrittoma di una cellula o di un tessuto – tutti gli RNA (mRNA, tRNA, rRNA, sncRNA, microRNA e siRNA) sono sequenziati e quantificati. In altre parole, possiamo dire che sia il romanzo, sia le trascrizioni conosciute, possono essere sequenziati.
Per farlo, l’intero set di RNA viene estratto dal campione di tessuto.,
Sequenziamento dell’RNA target:
Nel sequenziamento dell’RNA target-specifico vengono sequenziati un gruppo di trascrittomi gene-specifici, un pathway-specifici o correlati alla malattia.
Il sequenziamento dell’RNA target è più economico e preciso dell’intero sequenziamento del trascrittoma. Inoltre, meno quantità di campione di RNA è necessaria per fare l’esperimento.
Piccolo RNA sequenziamento:
Una delle tecniche più emergenti in RNA-sequenziamento è quello di studiare il più piccolo RNA non codificante di una cellula, perché quelli sono associati con tante funzioni in un genoma.,
Molecole di RNA più piccole come miRNA, siRNA e piRNA possono essere quantificate e sequenziate attraverso il metodo di sequenziamento dell’RNA basato su NGS per varie applicazioni.
Sequenza di mRNA:
Sequenziare l’intera trascrizione di mRNA utilizzando la selezione della coda di poli(A) utilizzata per gli studi di espressione genica. Utilizzando il sequenziamento mRNA noto così come nuova alterazione trascrizione può essere rilevato.
Vantaggi del sequenziamento dell’RNA:
Uno dei vantaggi fondamentali del sequenziamento dell’RNA è l’assenza di informazioni sulla sequenza precedente., Poiché l’intero processo non è basato sulla chimica basata sulla sonda, qui non sono richieste informazioni sulla sequenza precedente per la progettazione della sonda.
Si può fare uno studio di espressione genica più accurato e sensibile.
Gamma dinamica più ampia.
Cattura sia note che nuove alterazioni della trascrizione, anche se non sono disponibili informazioni sulla sequenza.
Anche se non sono disponibili informazioni sulla sequenza di riferimento, il sequenziamento dell’RNA può essere applicato per qualsiasi specie.
Correlati: Genoma sintetico-Metodi, applicazioni e sfide.,
Conclusione:
In conclusione possiamo dire che il metodo RNA seq è più avanzato e preciso rispetto al microarray. Inoltre, le mutazioni de novo possono anche essere scoperte usando.