Linee cellulari
La linea cellulare HEK 293T è stata ottenuta dalla American Type Culture Collection (ATCC CRL-3216). Linee cellulari di ibridoma di topo KT13 e KT22 sono state ottenute dagli studi di sviluppo Hybridoma Bank (DSHB). Entrambe le linee cellulari sono state depositate al DSHB da Kazumasa Takeda e Asako Sugimoto (DSHB hybridoma prodotti KT13 e KT22)., La linea cellulare 5E4 / 1F1 di Mouse hybridoma è stata gentilmente fornita da Miha Kosmač e Vladka Čurin Šerbec (Università di Lubiana). Le cellule HEK 293T e ibridoma sono state coltivate in DMEM (Gibco) integrato con 13% FBS (Gibco), 1× penicillina/streptomicina (Thermo Fisher) e 1× GlutaMAX (Gibco). Le sequenze anticorpali HC e LC di singoli ibridomi sono state determinate mediante reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa (RT-PCR) e sequenziamento capillare (Eurofins Genomics).,
Trattamento cicloesimide e preparazione microsomi
Tutte le fasi di pipettaggio sono state eseguite su ghiaccio e le centrifugazioni sono state effettuate a 4 °C utilizzando una centrifuga Eppendorf 5810R con rotore ad angolo fisso F-45-30-11. Le provette da centrifuga da 1,5 mL (Eppendorf) di Protein LoBind sono state utilizzate per ridurre al minimo l’adesione cellulare alle pareti del tubo. Cellule HEK 293T (1 milione), cellule di ibridoma di topo (1 milione di cellule 5E4, KT13 e KT22 mescolate in rapporto 1:1:1), cellule di leucemia ARH-77 (ATCC CRL-1621, 1 milione) o cellule umane CD19+ B appena isolate da campioni di immunizzazione pre e post Td – booster (1.,5 milioni ciascuno) sono stati risospesi in 1 ml di PBS con 50 µg/mL di cicloesimide e incubati per 10 minuti per bloccare i ribosomi con RNA messaggero associato (mRNA) sul reticolo endoplasmatico ruvido. Le cellule sono state appallottolato con 300 g per 10 min a 4 °C e risospese pipettando 15× su e giù in 120 µL ad alta densità di tampone di lisi (25 mM HEPES-KOH pH 7.2, 110 mM acetato di potassio, 5 mM acetato di magnesio, 1 mM EGTA, 25% di saccarosio , 5% di glicerina, 1 mM 1,4-ditiotreitolo, 1× completo EDTA-gratis inibitore della proteasi cocktail , 0,1 mg/mL cicloeximide, 0.015% digitonin, e 400 U/mL RiboLock RNase inhibitor )., La lisi delle cellule e degli organelli è stata completata dall’incubazione per 10 min su ghiaccio. Ogni omogenato è stato diviso in due aliquote da 55 µL e trasferito in due provette di LoBind proteico fresco. I tubi sono stati centrifugati a 600 g per 3 min a 4 °C per pellet nuclei e detriti cellulari. Un totale di 40 µL di surnatante da ciascun tubo, contenente frazioni di membrana e citosol, sono stati trasferiti in tubi freschi di LoBind proteico e la concentrazione di saccarosio è stata diluita a 0,37–0,40 M (12-13% p/p) mediante l’aggiunta di 40 µL di acqua priva di nucleasi. I microsomi sono stati poi sedimentati mediante centrifugazione con 20.800 g per 120 min a 4 °C., Il citosol contenenti supernatanti sono stati scartati e membrana pellet sono state risospese pipettando 10× su e giù per l ‘ 85 µL di tampone di lavaggio (25 mM HEPES-KOH pH 7.2, 110 mM acetato di potassio, 2.5 mM acetato di magnesio, 1 mM EGTA, 1 mM 1,4-ditiotreitolo, 1× completo EDTA-gratis inibitore della proteasi cocktail, 0,1 mg/mL cicloeximide, 0,004% di digitonin, e 400 U/ml RiboLock RNase inhibitor). I microsomi sono stati nuovamente sedimentati mediante centrifugazione con 20.800 g per 60 min a 4 °C., I supernatanti sono stati scartati e i pellet di microsomi sono stati risospesi in 20 µL di tampone di lavaggio e tenuti sul ghiaccio fino a nuovo utilizzo.
Microscopia elettronica a trasmissione
Aliquote campione di 3,5 µL di microsomi HEK 293T risospesi sono state applicate a griglie Quantifoil appena scaricate a incandescenza (Quantifoil, Germania) ricoperte da un ulteriore film di supporto al carbonio di 2 nm e congelate a flash in etano liquido utilizzando uno stantuffo Vitrobot (FEI). I campioni sono stati ripresi su un microscopio elettronico a trasmissione spiritica Tecnai (FEI) operato a 120 kV dotato di una telecamera CCD Eagle 2 × 2 k (FEI)., I micrografi sono stati registrati in condizioni di crio-bassa dose a 42.000 × di ingrandimento nominale (dimensione dei pixel in scala dell’oggetto: 5,2 Å/px) applicando una sfocatura da − 2 a − 4 µm. La raccolta dei dati è stata eseguita manualmente o completamente automaticamente utilizzando Leginon .
Emulsion RT-PCR assembly using mouse hybridoma microsomes
Abbiamo diluito 16 µL di microsomi risospesi da ibridomi misti 5E4, KT13 e KT22 in 184 µL RT-PCR master mix contenente 1× Verso 1-Step RT-PCR master mix (Thermo Scientific), 1× Verso enzyme mix (Thermo Scientific), 0.,5 µg/µL BSA, 100 µg/mL cicloesimide e primer per la trascrizione inversa e l’assemblaggio di HC e LC (0,8 µM ciascuno dei primer TitA_MID1_IgM_rev e TitB_MID12_IgK_rev; 0,16 µM ciascuno dei primer OE_MHV_fwd e OE_MKV_fwd). Le sequenze di primer sono mostrate nel file aggiuntivo 1: Figura S1a. I 200 µL di soluzione acquosa risultanti sono stati utilizzati per formare un’emulsione acqua-in-olio mediante aggiunta a goccia (13 aliquote di 15 µL in intervalli di 30-s) a 800 µL di fase oleosa secondo Ge et al. (Olio minerale, Sigma M5904, con 4.5% Span 80, Sigma S6760, 0.4% Tween 80, Sigma P8074, e 0.,05% Triton X-100, Sigma T8787) durante l’agitazione continua su un agitatore magnetico., Sei aliquote di 100 µL di ogni conseguente emulsione sono stati trasferiti in provette per PCR e sottoposto a thermocycling con le seguenti condizioni: trascrizione inversa a 50 °C per 15 min, RTase inattivazione a 95 °C per 2 min, poi quattro cicli di denaturazione a 95 °C per 20 s, ricottura rampdown da 60 °C a 50 °C per 50 s e l’estensione a 72 °C per 1 min, poi a 16 cicli di denaturazione a 95 °C per 20 s, la ricottura a 60 °C per 30 s e l’estensione a 72 °C per 1 min, seguita da una estensione finale step a 72 °C per 5 min., In parallelo, è stato eseguito un controllo RT-PCR aperto diluendo 4 µL di microsomi risospesi in 46 µL RT-PCR master mix e termociclando la reazione in parallelo con l’emulsione RT-PCR. I prodotti di assemblaggio PCR sono stati estratti dall’emulsione utilizzando isobutanolo (2-Metil-1-propanolo, Sigma) e il kit Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Zymo Research) come precedentemente pubblicato . Il DNA risultante e il prodotto PCR dal controllo PCR aperto sono stati caricati su un gel di 1,2% TBE-agarosio e separati con 90 V per 60 min., I prodotti di assemblaggio di dimensioni 800-950 bp sono stati selezionati dal gel di agarosio e i prodotti sono stati recuperati utilizzando un kit di recupero del DNA del gel Zymoclean. I prodotti di assemblaggio sono stati eluiti in Tris-Cl pH 8 da 6 mm e conservati a − 20 °C fino a ulteriori analisi.,
Nested PCR amplificazione del mouse ibridoma prodotti di montaggio
Dopo l’emulsione assemblea di reazione, l’assemblea prodotti sono stati ulteriormente amplificato con adattatore primer TitA_fwd, 5′ CGT ATC GCC TCC CTC GCG CCA TCA G 3′, e TitB_rev, 5′ CTA TGC GCC TTG CCA GCC CGC TCA G 3′, utilizzando il Phusion ad alta fedeltà polimerasi del DNA kit (Finnzymes) con il seguente thermocycling condizioni: denaturazione Iniziale a 98 °C per 30 s, quindi 15 cicli di denaturazione a 98 °C per 7 s e ricottura/estensione a 72 °C per 30 s, seguita da una estensione finale step a 72 °C per 5 min., I prodotti PCR sono stati purificati con il kit Zymo DNA Clean & Concentrator-5. L’associazione di HC e di LC in assemblea prodotti sono stati poi analizzati mediante nested PCR utilizzando primer specifici per i tre diversi HC e tre diversi LC (file Aggiuntive 1: Figura S1e) utilizzando il Phusion ad alta fedeltà DNA polimerasi kit con i seguenti thermocycling condizioni: denaturazione iniziale a 98 °C per 30 s, quindi 24 cicli di denaturazione a 98 °C per 7 s e ricottura/estensione a 72 °C per 30 s, seguita da una estensione finale step a 72 °C per 5 min., I prodotti PCR nidificati sono stati caricati su un gel di 1,2% TBE-agarosio e separati con 90 V per 40 min. In tempo reale nested PCR per la quantificazione di cross-contaminazione è stata effettuata nel triplica con lo stesso nidificati primer utilizzando SYBRGreen master mix (Applied Biosystems) su un StepOne qPCR cycler (Applied Biosystems), con la seguente thermocycling condizioni: denaturazione iniziale a 95 °C per 10 min, seguita da 40 cicli di denaturazione a 95 °C per 15 s, ricottura a 56 °C per 30 s e l’estensione a 72 °C per 45 s., Le abbondanze iniziali dei prodotti di assemblaggio amplificati sono state calcolate usando il metodo 2^(-deltaCt) e tracciate come grafici a barre con barre di errore che mostrano la deviazione standard dalla media.
Immunizzazione e isolamento delle cellule CD19+ B da campioni di sangue intero periferico
I campioni di sangue intero periferico umano utilizzati in questo studio sono stati ottenuti da in.vent Diagnostica GmbH come sottoprodotti da procedure diagnostiche di routine. in.,vent Diagnostica GmbH ha il consenso informato scritto del donatore per utilizzare i sottoprodotti per la ricerca e ha un’approvazione etica dalla Commissione etica internazionale di Friburgo (codice FEKI 011/1763) per la distribuzione dei campioni. Un probando sano è stato sottoposto ad immunizzazione di richiamo con tossoide tetanico (TT)/Tossoide dipterico (DT) (Td-pur®; 20 unità internazionali TT e 2 UI DT; Novartis, Basilea, Svizzera)., Il sangue intero periferico K2-EDTA derivato dalla pre-immunizzazione (giorno 0) e sette giorni dopo l’immunizzazione di richiamo Td è stato utilizzato per isolare le cellule CD19+ B utilizzando il kit di separazione cellulare pluriBead CD19 (pluriSelect GmbH, Leipzig, Germania) seguendo il protocollo del produttore. I pellet isolati di cellule CD19 + B sono stati lavati in 1 mL di PBS freddo e centrifugati a 300 g per 10 min a 4 °C. I pellet di cellule corrispondenti a 1,5 milioni di cellule B provenienti da campioni pre e post – immunizzazione sono stati tenuti su ghiaccio fino al trattamento con cicloesimide e alla preparazione del microsoma.,
Emulsion RT-PCR assembly using human B cell microsomes
Abbiamo aggiunto 2 µL di microsomi diluiti preparati da cellule ARH-77 congelate (come controllo di accoppiamento interno) a 26 µL di microsomi risospesi da cellule B sia pre – che post-Td immunizzazione, in modo che la frazione finale di microsomi ARH-77 è 0.5% (v / v). Abbiamo diluito 16 µL di questa sospensione di microsomi in 184 µL RT-PCR master mix contenente 1 × dART 1-step RT-PCR master buffer mix (Roboklon), 2× Dart master enzyme mix (Roboklon), 0.,5 µg/µL BSA, 100 µg/mL cicloesimide e primer per trascrizione inversa (IgM, IgG e IgK) e assemblaggio pesante (VH) e catena leggera (VK). Le sequenze di primer e le concentrazioni nel master mix RT-PCR sono elencate nel file aggiuntivo 1: Tabella S2., La risultante 200 µL di soluzione acquosa sono stati utilizzati per formare acqua-in-olio emulsione aggiunta di reagenti (13 aliquote di 15 µL in intervalli di 30 s) a 800 µL di olio fase di composto per il 73% emulsione componente 1, 7% emulsione componente 2, e 20% emulsione componente 3 del Micellula DNA emulsione e kit per la purificazione (Roboklon) durante l’agitazione continua su un agitatore magnetico., Sei aliquote di 100 µL di ogni conseguente emulsione sono stati trasferiti in provette per PCR e sottoposto a thermocycling con le seguenti condizioni: trascrizione Inversa a 55 °C per 30 min, iniziale di denaturazione a 95 °C per 3 min, poi tre cicli di denaturazione a 95 °C per 20 s, ricottura a 56 °C per 30 s e l’estensione a 72 °C per 2 min, poi a 20 cicli di denaturazione a 95 °C per 20 s, la ricottura a 56 °C per 30 s e l’estensione a 72 °C per 4 min, seguita da una estensione finale step a 72 °C per 5 min., I prodotti di assemblaggio PCR sono stati estratti dall’emulsione utilizzando isobutanolo (2-Metil-1-propanolo, Sigma) e il kit Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Zymo Research) come precedentemente pubblicato . I DNA risultanti sono stati caricati su un gel 1% di TBE-agarosio e separati con 100 V per 45 min. I prodotti di assemblaggio di 700-800 bp sono stati selezionati dal gel di agarosio, recuperati utilizzando un kit di recupero del DNA del gel Zymoclean, eluiti in 6 mM Tris-Cl pH 8 e conservati a-20 °C fino a ulteriori analisi.,
Amplificazione PCR nidificata di prodotti di assemblaggio di cellule B umane
Per un’ulteriore amplificazione specifica dei prodotti di assemblaggio HC-LC, è stata eseguita un’amplificazione PCR nidificata con primer nidificati specifici per regioni costanti IgM, IgG e IGK (File aggiuntivo 1: Tabella S2). La reazione PCR conteneva primer nidificati a concentrazioni di 0,4 µM, 200 µM dNTP mix, 1 × Q5 reaction buffer e 0,02 U/µL Q5 DNA polimerasi ad alta fedeltà (New England Biolabs) in un volume di reazione di 50 µL con 3 µL di DNA assemblato., L’amplificazione PCR nidificata è stata eseguita con le seguenti condizioni di termociclaggio: denaturazione iniziale a 98 °C per 3 min, quindi 34 cicli di denaturazione a 98 °C per 30 s e ricottura/estensione a 71 °C per 1 min, seguita da una fase di estensione finale a 72 °C per 5 min. I campioni sono stati raccolti dopo tre diversi numeri di ciclo PCR (28, 31 e 34 cicli). I prodotti PCR amplificati sono stati caricati su gel 1% TBE-agarosio e separati con 100 V per 60 min., I prodotti desiderati di ~ 710 bp sono stati estratti come descritto sopra, le librerie di sequenziamento sono state preparate seguendo la guida alla preparazione del campione di DNA Illumina TruSeq e le letture accoppiate di base 2 × 250 sono state sequenziate utilizzando la piattaforma Illumina MiSeq.
L’analisi bioinformatica dei repertori accoppiati della catena pesante e leggera dell’anticorpo
Demultiplexing di 2 × 250 letture accoppiate-fine della base dalla piattaforma di sequenziamento di MiSeq è stata eseguita basata sugli indici dell’adattatore ed i dati di sequenziamento sono stati ottenuti nel formato di fastq., Solo letture con punteggi minimi di qualità Phred di 10 oltre il 50% di tutti i nucleotidi sono stati conservati e scansionati per IgM, IgG e sequenze di regioni costanti IgK. Le coppie di lettura prive di sequenze di regioni costanti o che mostrano la struttura HC-HC o LC-LC sono state filtrate e le letture rimanenti sono state convertite in formato fastq e utilizzate come input per l’analisi con MiXCR (v1.2) per l’allineamento delle letture alle sequenze geniche di riferimento V(D)J e C dal database IMGT , estrazione e clustering del nucleotide CDR-H3 (File aggiuntivo 1: Tabella S1)., Le sequenze HC-CDR3 contenenti frameshifts o stop codons e con meno di due letture sono state filtrate. Abbiamo creato un file di statistiche di accoppiamento HC-LC per dimostrare l’utilizzo del gene VH-VK accoppiato nei repertori di geni HC-LC accoppiati totali. Le mappe di calore sono state generate usando R e visualizzate graficamente usando ggplot2. Successivamente, sequenze interindividuali TT-specifiche HC-CDR3 sono state identificate confrontando sequenze aminoacidiche HC-CDR3 ottenute dal campione di immunizzazione di richiamo post-Td con sequenze HC-CDR3 specifiche TT-precedentemente riportate .,
Amplificazione PCR di sequenze HC e LC a lunghezza intera
Abbiamo progettato un metodo di amplificazione basato su PCR in due fasi (file aggiuntivo 1: Figura S5) per incorporare siti di digestione di restrizione a HC e LC potenzialmente TT-specifici con sequenza genica V(D)J completa. Ciò ha permesso la clonazione efficiente delle sequenze HC e LC nei rispettivi vettori di espressione, nonché la produzione di anticorpi ricombinanti per studi di legame in vitro., In breve, abbiamo selezionato 14 clonotipi accoppiati HC-LC CDR3 ottenuti da IgG che sequenziano l’immunizzazione di richiamo post-Td in base alla loro frequenza, precisione di accoppiamento e differenza di piega tra top1 LC-CDR3 e top2 LC-CDR3 accoppiati alla sequenza HC-CDR3 data. Abbiamo estratto l’RNA totale da cellule B congelate isolate dall’immunizzazione del booster post-Td utilizzando la purificazione del reagente TRIzol (Ambion) secondo le istruzioni del produttore. Nella prima fase, l’amplificazione RT-PCR per ogni clonotipo HC – e LC-CDR3 selezionato è stata eseguita separatamente utilizzando il kit RT-PCR DART 1-step (Roboklon)., La master mix RT-PCR (25 µL) conteneva primer HC e LC V gene-specifici con sporgenze del sito di restrizione BssHII insieme a singoli primer CDR3-specifici con 18 nucleotidi della regione FR4 a concentrazioni di 0,4 µM (File aggiuntivo 1: Tabella S3 e Figura S5), 1× DART 1-step RT-PCR master buffer mix, 1× DART master enzyme mix e 4,5 ng di RNA totale., Le condizioni di termociclaggio erano le seguenti: trascrizione inversa a 55 °C per 30 min, denaturazione iniziale a 95 °C per 3 min, quindi 23 cicli di denaturazione a 95 °C per 20 s, ricottura a 56 °C per 30 s ed estensione a 72 °C per 90 s, seguita da una fase finale di estensione a 72 °C per 5 min. I prodotti RT-PCR sono stati purificati utilizzando il kit di purificazione Agencourt AMPure XP – PCR (Beckman Coulter) seguendo le istruzioni del produttore ed eluiti in 6 mM Tris-Cl pH 8.0., Nella seconda fase, i prodotti RT-PCR purificati sono stati utilizzati come modello per l’amplificazione della PCR utilizzando la DNA polimerasi ad alta fedeltà Q5 (New England Biolabs). La master mix PCR nidificata (50 µL) conteneva primer avanzati che codificano un sito di restrizione BssHII e tre nucleotidi della sequenza genica germinale HC o LC insieme a primer inversi contenenti la regione FR4 completa e sporgenze di restrizione NheI/HindIII a concentrazioni di 0,4 µM (file aggiuntivo 1: Tabella S3 e Figura S5), 4 µL di DNA purificato, 200 µM dNTP mix, 1× Q5 reaction buffer e 0.,02 U / µL Q5 DNA Polimerasi ad alta fedeltà (New England Biolabs). Le condizioni di termociclaggio erano le seguenti: denaturazione iniziale a 98 ° C per 3 min, poi 16 cicli di denaturazione a 98 °C per 30 s, ricottura a 69 °C per 30 s ed estensione a 72 °C per 1 min, seguita da una fase finale di estensione a 72 °C per 5 min. I prodotti per PCR sono stati separati su un gel di TBE-agarosio, gli ampliconi HC e LC a lunghezza intera con siti di digestione di restrizione sono stati estratti dal gel utilizzando il kit di recupero del DNA del gel Zymoclean (Zymo Research) e i prodotti sono stati conservati a − 20 °C fino a nuovo uso.,
Clonazione ed espressione di anticorpi monoclonali ricombinanti
Digestione di restrizione di inserti HC e LC a lunghezza intera e vettori di espressione (pCMV-CD30-4IE3_HC e pCMV-CD30-4IE3_LC) è stata eseguita con gli enzimi di restrizione BssHII, NheI e HindIII (New England Biolabs). I prodotti risultanti sono stati caricati su gel 2% TBE-agarosio e bande di ~ 5,9 kb per la dorsale vettoriale HC, 5,3 kb per la dorsale vettoriale LC, ~ 370 bp per gli inserti HC e ~ 340 bp per gli inserti LC sono stati selezionati in base alle dimensioni sui gel di agarosio e purificati come descritto sopra., Le legature degli inserti e dei vettori corrispondenti per i clonotipi HC e LC amplificati sono state eseguite utilizzando la DNA ligasi istantanea (New England Biolabs) e trasformate in cellule di E. coli TOP10 (IBA) chimicamente competenti in un solo colpo seguendo le istruzioni del produttore. I DNA plasmidici sono stati isolati da colonie trasformate (8-16 colonie) utilizzando il kit QIAprep spin miniprep (Qiagen); le somiglianze con le sequenze di consenso sono state confermate utilizzando il sequenziamento capillare di Sanger., Le sequenze di DNA plasmidico HC e LC che corrispondevano più vicine alle sequenze di consenso sono state co-trasfette in cellule della linea cellulare renale embrionale umana HEK 293 T (ATCC, CRL-11268). Le cellule di HEK 293 T sono state coltivate facendo uso del glucosio ricco (4.5 g / L D-glucosio) Il medium modificato dell’aquila di Dulbecco (Gibco BRL) integrato con il siero bovino fetale ultra-basso IgG inattivato calore (Thermo Fisher Scientific), la penicillina 100 U/ml e la streptomicina 100 µg/ml. I DNA plasmidici purificati per clonotipi HC e LC accoppiati sono stati co-trasfettati in cellule T HEK 293 confluenti all ‘ 85-95% utilizzando PEI (polietilenammina, Poliscienze)., I surnatanti in coltura sono stati raccolti quattro giorni dopo la trasfezione e i clonotipi TT antigene-specifici sono stati identificati mediante ELISA indiretta.
Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA)
Abbiamo eseguito test ELISA indiretti per identificare MABS derivati dal probando immunizzato che si lega all’antigene TT utilizzando i supernatanti di coltura cellulare transfettata. Le piastre solide Nunc-Immuno MicroWell 96-well (Thermo Fisher Scientific) sono state rivestite con 100 µL di antigene TT 10 µg/mL (Statens Serum Institute, Copenhagen, Danimarca) in tampone carbonato da 50 mM pH 9.,6, incubato durante la notte a 4 °C, lavato tre volte con PBS e bloccato con latte secco 2% non grasso (Bio-Rad) in PBS per 150 min a temperatura ambiente. Dopo il blocco, 120 µL di 1:2 surnatanti trasfettati in serie diluiti in PTM (PBS, 0,1% Tween-20, 2% latte secco non grasso) sono stati aggiunti ai pozzetti, 350 ng di MAB anti-TT del topo (GeneTex) sono stati applicati a un pozzetto come controllo positivo e le piastre sono state incubate per 1 h a temperatura ambiente. Le piastre sono state lavate tre volte con PBS-T (0.,1% Tween-20) e 50 µL di una 1:2000 diluizione di capra anti-uomo kappa LC-HRP coniugato anticorpo secondario (Thermo Fisher Scientific) sono stati aggiunti ai pozzetti, 50 µL di una 1:2000 diluizione di capra anti-IgG di topo HC-HRP coniugato anticorpo secondario (Sigma #A0168) sono stati aggiunti per il controllo positivo bene, le piastre sono state incubate per 2 min a temperatura ambiente e lavate tre volte con PBS-t Per lo sviluppo del colore, abbiamo aggiunti 50 µL di one-step Ultra TMB-ELISA substrato (Thermo Fisher Scientific) per bene, incubare le piastre per 5 min a temperatura ambiente, e si è fermato Ag:Ab reazione di legame con aggiunta di 50 µL 2 M di H2SO4., L’assorbanza è stata misurata a 450 nm utilizzando il GloMax Multi Detection System (Promega). I test ELISA per tutti i clonotipi sono stati eseguiti in triplicati, i valori sono stati normalizzati per rimuovere i segnali di fondo e gli errori sono stati rappresentati come deviazioni standard dalla media.
Analisi della formazione di ampliconi chimerici durante la PCR nidificata
Quattro ampliconi HC-LC definiti sono stati generati amplificando l’HC e l’LC dai rispettivi plasmidi pCMV (vedi sopra) e utilizzando una reazione di assemblaggio PCR per generare i quattro gruppi HC-LC distinti., I DNA plasmidici HC e LC sono stati utilizzati come modelli per l’amplificazione PCR delle coppie di catene clonali Top1, Top2, Top3 e Top4 utilizzando primer specifici per le rispettive famiglie di geni VH e VK e regioni costanti IgG e IgK (File aggiuntivo 1: Tabella S2 e Figura S6a). DNA plasmidico purificato (10 ng) è stato aggiunto a ciascuna reazione PCR da 25 µL contenente 0,4 µM di ciascun primer, miscela dNTP da 200 µM, tampone di reazione 1× Q5 e DNA polimerasi ad alta fedeltà 0,2 U/µL Q5., Cicli termici è stata eseguita con iniziale denaturazione a 98 °C per 3 min, seguita da 25 cicli di denaturazione a 98 °C per 30 s, ricottura/estensione al 71 °C per 1 min (HC plasmide DNA) o ricottura a 64 °C per 1 min e l’estensione a 72 °C per 1 min (LC DNA del plasmide), seguita da una estensione finale step a 72 °C per 5 min. I prodotti PCR sono stati caricati su gel separati all ‘ 1% di TBE-agarosio e separati con 100 V per 60 min. I prodotti di DNA desiderati di ~ 400 bp (per HC) e ~ 350 bp (per LC) sono stati selezionati in base alle dimensioni ed estratti dal gel come descritto sopra., I prodotti per PCR HC e LC purificati sono stati utilizzati come modelli per l’assemblaggio HC e LC mediante overlap extension PCR (file aggiuntivo 1: Figura S6b). In breve, 5 ng di ogni HC e corrispondente DNA LC accoppiato sono stati aggiunti in ogni reazione PCR da 50 µL contenente 1× Dart 1-step RT-PCR master buffer (Roboklon), 2× Dart master enzyme (Roboklon) e 0,4 µM di ogni IgG e IgK constant region primer (file aggiuntivo 1: Tabella S2)., Cicli termici è stata eseguita con RT inattivazione a 95 °C per 3 min, seguito da tre cicli di denaturazione a 95 °C per 20 s, ricottura a 56 °C per 30 s e l’estensione a 72 °C per 2 min, seguita da 25 cicli di denaturazione a 95 °C per 20 s, ricottura a 56 °C per 30 s e l’estensione a 72 °C per 4 min, seguita da una estensione finale step a 72 °C per 5 min. I prodotti di assemblaggio sono stati caricati su gel 1% TBE-agarosio e separati con 100 V per 45 min. I prodotti dell’assemblea di ~ 750 bp sono stati dimensione-selezionati ed estratti dal gel dell’agarosio come descritto sopra., Le coppie clonali HC-LC assemblate singolarmente sono state raggruppate e utilizzate come modello per amplificazione PCR nidificata con primer specifici per regioni costanti IgG e IgK (File aggiuntivo 1: Tabella S2, Figura S6c). La reazione PCR nidificata e le condizioni di ciclo termico erano le stesse descritte nella sezione “Amplificazione PCR nidificata di prodotti di assemblaggio di cellule B umane”, tranne per il fatto che l’amplificazione PCR è stata eseguita per 25 cicli. I prodotti PCR sono stati caricati su gel 1% di TBE-agarosio, separati con 100 V per 60 min e i prodotti desiderati di ~ 720 bp sono stati estratti come descritto sopra., Le librerie di sequenziamento dai singoli assembly e dagli assembly misti dopo la PCR nidificata sono state preparate seguendo la guida alla preparazione del campione di DNA Illumina TruSeq e le letture accoppiate di base 2 × 250 sono state generate utilizzando la piattaforma Illumina MiSeq.