PCR to technika nowoczesnych laboratoriów biologii molekularnej. Jeśli chcesz skopiować, sekwencję lub ilościowo określić DNA, musisz znać PCR. W skrócie, PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy) jest biochemiczną techniką, która wykorzystuje termocykling i enzymy do szybkiego i niezawodnego kopiowania DNA, i została wynaleziona w błysku inspiracji przez naukowca jazdy na autostradzie 128 Z San Francisco do Mendocino.,
Ten artykuł zawiera krótkI, podstawowy przegląd PCR, z kilkoma wskazówkami, które pomogą Ci uniknąć najczęstszych pułapek. Jeśli jesteś nowy lub stosunkowo nowy w PCR, to jest to dla Ciebie. (A nawet jeśli masz doświadczenie w PCR, warto przeczytać, aby odświeżyć, a może chwycić napiwek lub dwa!).
podstawowe składniki PCR:
polimeraza
polimerazy są enzymami, które w odpowiednich warunkach mogą tworzyć nowe nici DNA z wzorca DNA i nukleotydów. Pierwotna reakcja PCR była uciążliwa, ponieważ wysokie temperatury potrzebne do denaturacji DNA zabiłyby polimerazy., Oznaczało to, że po każdym cyklu ogrzewania, nowe polimerazy musiały być ręcznie dodawane do reakcji– kosztowne przedsięwzięcie. Jednak w nowoczesnym PCR nie jest to problem, jak polimerazy stosowane w nowoczesnym PCR zazwyczaj pochodzą z jednego z dwóch termofilnych źródeł bakterii, Thermus aquaticus lub Pyrococcus furiosus. Polimerazy te, odpowiednio, Taq (wymawiane „tack”) i Pfu (wymawiane „P-F-U”) łatwo wytrzymują wysokie temperatury związane z reakcją PCR., Komercyjne polimerazy Taq i Pfu zostały zaprojektowane z myślą o szybkości, wierności, processivity (zdolność do wykonywania długich odczytów) i ich zdolności do odczytu szablonów bogatych w GC. Firmy ciągle wychodzą z nowymi polimerazami. Dlatego nie zadowalaj się „tym, co jest w Twojej zamrażarce”, ale rozejrzyj się za najlepszą komercyjną polimerazą dla Twoich potrzeb PCR. Porozmawiaj również z lokalnym przedstawicielem handlowym, ponieważ często mogą rozdawać bezpłatne próbki polimerazy, dzięki czemu możesz zdecydować, co jest dla ciebie najlepsze.
szablon DNA
To jest DNA, do którego projektujesz swoje podkłady., To DNA, które wasza polimeraza odczyta i skopiuje. Twój szablon DNA może być genomiczny, plazmid lub cDNA, ale bez względu na jakość źródła liczy. Im bardziej nienaruszone i czystsze DNA szablonu, tym łatwiej jest uzyskać dobre wyniki PCR. Należy również pamiętać, że idealna ilość DNA zależy od źródła, zwykle 1 pg-1 ng plazmidowego DNA lub 1 ng-1 µg genomowego DNA na reakcję PCR.
Primery
Primery to krótkie fragmenty zsyntetyzowanego DNA, które wiążą się z Twoim wzorcowym DNA. Będziesz musiał zaprojektować jeden podkład „do przodu” i jeden podkład „do tyłu”., Twój przedni podkład wyznacza początek PCR. Sekwencja tego podkładu jest taka sama jak Sekwencja 5-3 wzorcowego DNA. Odwrócony podkład oznacza koniec PCR. Sekwencja tego podkładu jest odwrotnym uzupełnieniem Twojego wzorcowego DNA. Na ogół podkładki mają 18-22 pary bazowe długości. Jednak ważniejsza od ich długości jest temperatura topnienia podkładów. Temperatura topnienia podkładów powinna wynosić 54-60°C i być jak najbardziej zbliżona do siebie., Istnieje wiele kalkulatorów online, które mogą obliczać temperatury wyżarzania podkładu, a większość firm, które syntetyzują podkłady, dostarcza takie kalkulatory.
nukleotydy
jako monomery DNA, nukleotydy są niezbędne do tworzenia kopii DNA. Dla większości DNA PCRs będziesz używać deoxynucleoside triphosphates (dNTPs). Można je kupić osobno lub jako mieszankę dGTP, dctp, dATP i dTTP. Cokolwiek kupisz, pamiętaj, że nukleotydy są bardzo wrażliwe na cykle zamrażania/rozmrażania. Dlatego najlepiej zawsze tworzyć małe podliczniki dntp., Upewnij się również, że prawidłowo je przechowujesz – nie używaj zamrażarki bez mrozu, która przechodzi automatyczne cykle rozmrażania.
Bufor
większość komercyjnych polimeraz jest dostarczana z ich idealnym buforem. Bufory te nie tylko zapewniają prawidłowe pH, ale zawsze mają dodatki, takie jak magnez, potas lub DMSO, które pomagają zoptymalizować denaturowanie DNA, renaturowanie i aktywność polimerazy. Więcej o tych dodatkach będzie można przeczytać w nadchodzącym artykule.
Thermocycling:
tutaj dzieje się magia., Wszystkie powyższe składniki są dodawane do rurki PCR, a rurka jest termocyklowana. W celu uzyskania termocyklingu, gdy PCR został po raz pierwszy wynaleziony, poszczególne rury PCR były ręcznie przenoszone między podgrzewanymi łaźniami wodnymi. (I uważasz, że praca na ławce jest nudna!) Teraz, dzięki wynalezieniu „Mr. Cycles”, pierwszej Maszyny do termocyklingu, regulacja temperatury odbywa się teraz automatycznie przez termocyklery. Poniżej znajduje się typowy profil termocyklera PCR:
Inicjalizacja
w tym etapie reakcja jest podgrzewana do temperatury 94-96°C przez 30 sekund do kilku minut., Ten krok jest zwykle wykonywany tylko raz na samym początku reakcji PCR. Ten krok jest ważny dla aktywacji polimerazy na gorąco, jeśli używasz takiej polimerazy, oraz dla denaturowania twojego wzorcowego DNA. Należy pamiętać, że jeśli zawartość szablonu GC jest wysoka, konieczne może być wykonanie bardzo długiego kroku inicjalizacji.
denaturacja (powtarzana 15-40 razy)
w tym etapie reakcja ogrzewa się do temperatury 94-98°C przez 15-30 sekund. Ten krok denaturuje DNA i podkłady, które pozwolą im wyżarzać się nawzajem w następnym kroku.,
wyżarzanie (powtarzane 15-40 razy)
w tym kroku temperatura reakcji jest szybko obniżana do 50-64°C przez 20-40 sekund. Temperatura na tym etapie musi być na tyle niska, aby denaturowane podkłady mogły tworzyć pary zasad Watson-Crick z wzorcowym DNA. Ale na tyle wysoka, że tylko najbardziej stabilne (idealnie sparowane) dwuniciowe struktury DNA mogą tworzyć. Zwykle ta doskonała temperatura wyżarzania jest o kilka stopni niższa niż temperatura topnienia pary podkładu. Również podczas tego etapu polimeraza wiąże się z kompleksem DNA primer/template., Chociaż polimeraza nie zacznie odczytywać, dopóki temperatura nie wzrośnie w następnym kroku.
wydłużenie lub wydłużenie (powtarzane 15-40 razy)
w tym etapie reakcja jest szybko podgrzewana do 72-80°C. Wtedy polimeraza rozpocznie odczyt (w kierunku 5-3) i kopiowanie wzorcowego DNA (w kierunku 3-5). Wyższa temperatura podczas tego etapu zmniejsza niespecyficzne interakcje primer / template DNA, zwiększając w ten sposób swoistość reakcji., Jednak dokładna temperatura będzie zależeć od preferencji polimerazy, więc przeczytaj opakowanie. Długość tego kroku zależy od tego, jak długo będzie twoja kopia DNA. Zazwyczaj polimeraza DNA może kopiować 1000 par zasad na minutę. Dlatego musisz poświęcić co najmniej 1 minutę czasu rozszerzenia na 1000 baz. Pod koniec tej inkubacji zostaną utworzone nowe dwuniciowe fragmenty DNA, składające się zarówno z szablonu, jak i nowego DNA.
krok 2-4 są następnie powtarzane 15-40 razy
prawdą jest, że im więcej cykli zaprogramujesz, tym więcej kopii DNA utworzysz., Istnieje jednak górna granica. W pewnym momencie dostępne wolne nukleotydy stają się ograniczające i przedwcześnie okrojone kopie DNA mogą stać się problemem. Więc nie bądź chciwy z rowerem. Mniej, ale dobry czysty produkt PCR jest lepszy od wielu brudnych produktów.
wydłużenie końcowe
jest to opcjonalny, ale często zalecany krok. W tym etapie reakcja odbywa się w temperaturze 70-74°C przez kilka minut. (Zwykle używasz tej samej temperatury, co w kroku wydłużenia lub przedłużenia.) Ten krok pozwala polimerazom zakończyć odczyt dowolnego pasma, na którym są obecnie., Ten opcjonalny krok może pomóc zmniejszyć liczbę obciętych kopii w produkcie końcowym.
Ostatnie wstrzymanie
Twoja reakcja jest już zakończona. Ponieważ cały proces może potrwać kilka godzin, reakcje PCR są często wykonywane przez noc lub gdy w inny sposób ustąpił; zaleca się, aby zaprogramować termocykler do przechowywania produktu PCR w temperaturze 4°C, aż do powrotu. W tym czasie można analizować lub używać produktu lub przenieść go do bardziej odpowiedniego długoterminowego przechowywania, takiego jak lodówka.
powodzenia i powodzenia!
czy to ci pomogło?, Następnie podziel się z siecią.