RNA Sequencing-zasada, kroki, metody i zastosowania

” RNA sequencing jest wysoka przepustowość następnej generacji sekwencjonowanie metoda używana do analizy genów ekspresji i transkryptomika studia.”

kwas rybonukleinowy jest rodzajem kwasu nukleinowego w znacznym stopniu zaangażowanym w ekspresję genów, regulację genów i kodowanie/dekodowanie informacji.

mRNA – messenger RNA jest sekwencją kodującą genu zaangażowanego w syntezę białka, około 4% puli RNA składa się z mRNA, podczas gdy reszta to niekodujące RNA.,

chociaż około 90% RNA jest niekodujących, są one ważne dla wykonywania różnych funkcji.

na przykład

• tRNA – przenosi aminokwas do strony rybosomalnej, podczas gdy translacja.
• rRNA-rybosomalny RNA pomaga w translacji.
• mikroRNA-ekspresja genów i regulacja ekspresji genów.
• siRNA-chroni komórkę przed egzogennym RNA.

mRNA jest jednoniciowym kwasem nukleinowym transkrybowanym z genu i z którego białko jest tłumaczone.,

mRNA lub transkrypt zawiera tylko sekwencje kodujące z genu. W ten sposób posiada tylko sekwencje, które są wymagane w tworzeniu białka.

analizując mRNA można określić wzór ekspresji pokrewnego genu.

ponadto całkowite badanie RNA daje nam pojęcie o tym, które geny są związane z tworzeniem białek, a które nie.

oznacza, że ilość całkowitego RNA, mRNA i ncRNA może być określona przez badanie całkowitego RNA.,

Transkryptomika jest badaniem całego mRNA – często nazywanego transkryptomami lub całkowitym RNA obecnym w komórce lub populacji komórek.

analizując transkryptom komórki można zbadać całą pulę ekspresji genów. Jedną z ważnych technik stosowanych w badaniach transkryptomiki jest sekwencjonowanie RNA.

transkryptom organizmu jest większy, złożony i bardziej niepewny, w przeciwieństwie do genomu.

transkryptom różni się w różnym stanie i innym środowisku., Styl życia, dieta, ćwiczenia fizyczne, Środowisko, warunki i inne czynniki zewnętrzne odgrywają istotną rolę w regulacji transkryptomu.

tutaj w sekwencjonowaniu RNA, cDNA zsyntetyzowany z mRNA jest sekwencjonowany i oznaczany ilościowo w sekwencer. W niniejszym artykule omówimy tylko sekwencjonowanie RNA, ale wcześniej przeczytamy nasz poprzedni artykuł na temat transkryptomiki: czym jest Transkryptomika?,

zasada sekwencjonowania RNA:

sekwencjonowanie RNA jest metodą sekwencjonowania i kwantyfikacji RNA nowej generacji, o wysokiej przepustowości, stosowaną do badania transkryptomiki i ekspresji genów.

cDNA powstaje z całkowitego mRNA w procesie odwrotnej transkrypcji i fragmentacji. Symultaniczne, adaptor ligation i przygotowanie biblioteki są ćwiczone przed wykonaniem sekwencjonowania.

sekwencer odczytuje i kwantyfikuje cDNA komplementarne do mRNA.,

Steps in RNA-seq:

• RNA isolation
• cDNA synthesis
• Adaptor ligation
• Library preparation
• DNA fragmentation
• Sequencing
• Downstream applications

RNA isolation:

The first step in the RNA sequencing is the isolation of total RNA, mRNA or ncRNA for the experiment.,

izolowanie RNA jest żmudnym procesem w porównaniu z izolacją DNA. RNA można łatwo rozbić. Ponadto ryzyko skażenia jest wysokie w izolacji RNA.

dlatego należy zachować szczególną ostrożność podczas izolowania RNA i specjalistycznej ręki w tym celu.

czysty RNA o wysokiej wydajności musi być wymagany do sekwencjonowania RNA.

czystość i ilość RNA mierzy się za pomocą Nanodropu lub kubitu.

Note: for isolating mRNA from the total RNA pool, one additional step is required, using the oligo dT specific column in the purification or final step of elution, total mRNA can be isolated from the rest of RNAs.

teraz nasza próbka RNA jest gotowa do następnego kroku.,

odwrotna transkryptaza PCR:

inną innowacyjną metodą sekwencjonowania RNA jest odwrotna transkryptaza PCR, w której RNA jest odwrotną transkryptazą do DNA.

za pomocą specjalnego rodzaju polimerazy znanej jako odwrotna transkryptaza DNA, cDNA jest syntetyzowany z mRNA.

Dowiedz się więcej o RT PCR tutaj: Reverse transcriptase PCR.

synteza drugiej nici cDNA:

Po zsyntetyzowaniu cDNA z mRNA konieczna jest synteza drugiej nici DNA. W tym celu PCR jest wykonywany przy użyciu normalnej polimerazy DNA TAQ w konwencjonalnym PCR.,

polimeraza dodaje dNTPs do rosnącej nici DNA za pomocą zestawu podkładowego.

przygotowanie Biblioteki:

pierwszy krok w przygotowaniu biblioteki lub przygotowaniu biblioteki NGS rozpoczyna się od fragmentów.

za pomocą specjalnego typu endonukleaz restrykcyjnych cały zbiór DS cDNA jest fragmentowany dla NGS.

Uwaga:

przygotowanie biblioteki różni się w zależności od platformy, ponieważ niektóre fragmenty mRNA przed wykonaniem odwrotnej transkryptazy, podczas gdy niektóre wykonują ją później po przygotowaniu cDNA.,

w ostatnim etapie przygotowania biblioteki końce są ligowane z sekwencjami adapterów i wzmacniane w celu naprawy końców. dA-tailing jest opcjonalny W przypadku biblioteki mRNA.

oczyszczanie Biblioteki:

Cała Biblioteka jest oczyszczana za pomocą gotowego do użycia zestawu do oczyszczania DNA.

w ostatnim kroku bardzo ważne jest oczyszczenie całej biblioteki fragmentów, ponieważ stężenie biblioteki jest oceniane za pomocą ilościowego PCR lub bioanalyzera.,

Uwaga:

dla początkujących myślę, przygotowanie biblioteki i fragmentacja DNA jest bardzo trudne do zrozumienia, więc uważamy, powinniśmy napisać cały artykuł na temat fragmentacji genomowego DNA, przygotowanie biblioteki i jej znaczenie w NGS.

w każdym razie przejdźmy do przodu,

w następnym kroku próbka pofragmentowanego DNA jest wysyłana do sekwencjonowania.

sekwencjonowanie DNA:

teraz próbka jest sekwencjonowana w maszynie o wysokiej przepustowości NGS, która odczytuje sekwencję, a także kwantyfikuje kwas nukleinowy, jak również.,

Chemia stojąca za sekwencjonowaniem cDNA zależy od tego, z jakich platform korzystamy, chociaż powszechnie stosowaną metodą jest wykorzystanie chemii fluorescencyjnej.

w sekwencerze poszczególne fragmenty są „odczytywane” oddzielnie i sekwencjonowane. Ostateczne dane są przesyłane do laboratorium bioinformatycznego w celu analizy po sekwencjonowaniu.,

Different types of RNA and its function:

Abbreviation	RNA types	Function
mRNA	Messenger RNA	Codes for protein
tRNA	Transfer RNA	Transfer amino acid to the site of translation.,
rRNA	Ribosomal RNA	Catalyse the translation reaction
miRNA	microRNA	Gene regulation
siRNA	Smaller interfering RNA	Gene regulation and maintaining gene expression.
LncRNA	Long non-coding RNA	Transcriptional regulation and epigenetic regulations.,
snRNA	Small nuclear RNA	Helps in mRNA splicing and related functions
snoRNA	Small nucleolar RNA	Helps in RNA nucleotide modification
piRNA	Piwi-intercalating RNA	Function in defence against transposon; transposon defence system.
scaRNA	Small Cajal body-specific RNA	Also helps in nucleotide modifications (a type of snoRNA).,
shRNA	Small hairpin RNA	syntetyczna cząsteczka RNA pomaga w regulacji genów i kontrolowaniu ekspresji genów.

Analiza danych transkryptomu:

jednym z żmudnych zadań, jak już omówiliśmy w poprzednim artykule jest analiza danych transkryptomu i interpretacja wyników. Dane NGS są ogromne i bardziej złożone.,

szczerze mówiąc, nauczanie analizy danych transkryptomiki nie jest możliwe, trzeba wziąć praktyczną praktykę, aby się uczyć, jednak postaram się nauczyć, co dalej w tym procesie.

różne fragmenty są sekwencjonowane w maszynie i gromadzone są dane. W następnym kroku, w oparciu o obszar flankowania fragmentów, układane są tzw. „kontingi” dla uzyskania wariantów splotu.

w następnym kroku, transkryptom jest porównywany z sekwencją odniesienia lub może być złożony de novo.,

sekwencjonowanie całego transkryptomu:

cały transkryptom komórki lub tkanki – wszystkie RNA (mRNA, tRNA, rRNA, sncRNA, microRNA i siRNA) są sekwencjonowane i oznaczane ilościowo. Innymi słowy, możemy powiedzieć, zarówno powieści, jak i znane transkrypcje, mogą być uporządkowane.

aby to zrobić, cały zestaw RNA jest ekstrahowany z próbki tkanki.,

docelowe sekwencjonowanie RNA:

w docelowym sekwencjonowaniu RNA sekwencjonuje się specyficzne dla genu, klaster specyficznych dla genu, specyficznych dla ścieżki lub związanych z chorobą transkryptomów.

docelowe sekwencjonowanie RNA jest bardziej przystępne cenowo i dokładne niż całe sekwencjonowanie transkryptomu. Ponadto, mniejsza ilość próbki RNA jest wymagana do przeprowadzenia eksperymentu.

małe sekwencjonowanie RNA:

jedną z najbardziej pojawiających się technik w sekwencjonowaniu RNA jest badanie mniejszego niekodującego RNA komórki, ponieważ są one związane z tak wieloma funkcjami w genomie.,

mniejsze cząsteczki RNA, takie jak miRNA, siRNA i piRNA mogą być oznaczane ilościowo i sekwencjonowane za pomocą NGS opartej metody sekwencjonowania RNA dla różnych zastosowań.

sekwencjonowanie mRNA:

sekwencjonowanie całego transkryptu mRNA za pomocą selekcji Poli(a) ogona używanej do badań ekspresji genów. Za pomocą sekwencjonowania mRNA znane, jak również nowatorskie zmiany transkryptu można wykryć.

zalety sekwencjonowania RNA:

jedną z głównych zalet sekwencjonowania RNA jest brak potrzeby uprzedniej informacji o sekwencji., Ponieważ cały proces nie jest oparty na chemii opartej na sondach, wcześniejsze informacje o sekwencji do projektowania sondy nie są tutaj wymagane.

można wykonać dokładniejsze i bardziej czułe badanie ekspresji genów.

szerszy zakres dynamiki.

mimo braku informacji o sekwencji referencyjnej, sekwencjonowanie RNA może być stosowane dla każdego gatunku.

Related: syntetyczny Genom-metody, zastosowania i wyzwania.,

wniosek:

konklusywnie możemy powiedzieć, że metoda RNA seq jest bardziej zaawansowana i dokładna w porównaniu do microarray. Za jego pomocą można również odkryć mutacje de novo.