sekwencjonowanie genu 16S rRNA jest powszechnie stosowane do identyfikacji, klasyfikacji i ilościowania drobnoustrojów w złożonych mieszaninach biologicznych, takich jak próbki środowiskowe (ex woda morska) i próbki jelit (ex ludzki mikrobiom jelitowy)., Gen 16S rRNA jest wysoce zachowanym składnikiem transkrypcyjnej maszynerii wszystkich form życia opartych na DNA i dlatego jest wysoce odpowiedni jako gen docelowy do sekwencjonowania DNA w próbkach zawierających do tysięcy różnych gatunków. Uniwersalne primery PCR mogą być zaprojektowane tak, aby celować w konserwowane regiony 16S, co umożliwia amplifikację genu w szerokim zakresie różnych mikroorganizmów z pojedynczej próbki. Dogodnie, Gen 16S rRNA składa się zarówno z regionów konserwowanych i zmiennych (rys. 1)., Podczas gdy konserwowany region umożliwia uniwersalną amplifikację, sekwencjonowanie zmiennych regionów umożliwia dyskryminację między specyficznymi różnymi mikroorganizmami, takimi jak bakterie, archeea i drobnoustroje eukaria. Identyfikacja wirusów wymaga sekwencjonowania metagenomicznego (bezpośredniego sekwencjonowania całkowitego DNA wyekstrahowanego ze społeczności mikrobiologicznej) ze względu na brak filogenetycznego markera genu 16S.
Rys. 1 – Około 1.5 kb 16S Gen rRNA E. coli pokazujący dziewięć zmiennych regionów, które czynią go idealnym celem jako filogenetyczny marker genu.,
początkowo badania próbek środowiskowych wymagały uprawy i izolacji gatunków w celu identyfikacji, pracochłonnego i czasochłonnego procesu. Jednak połączenie 16S rRNA PCR z sekwencjonowaniem nowej generacji umożliwiło badanie wielu próbek przy niskich kosztach. Wczesne 16S badania sekwencjonowania rRNA już znaleziono wiele sekwencji, które nie należą do żadnego znanego hodowanych gatunków, co wskazuje, że istnieją liczne nieizolowane organizmy i że metody uprawy oparte znaleźć tylko niewielki procent bakterii i archaeal gatunków w próbce., Dodatkowo, dzięki multipleksowaniu wielu próbek i dużej głębokości pokrycia zapewnianej przez dzisiejsze platformy nowej generacji, możemy teraz analizować próbki z kompleksowych szeregów czasowych w celu określenia dynamiki społeczności mikrobiologicznej w wielu miejscach lub tworzyć szczegółowe mapy 3D społeczności mikrobiologicznych, a także badać, czy zmiany w rzadkich lub obfitych gatunkach są związane ze zdrowiem i chorobą.
Rys. 2 – grupowanie 5′ I 3′ odczytów z różnych próbek środowiskowych pokazuje, że próbki z danego typu środowiska klastra razem dobrze.,
odczyty z sekwencjonowania następnej generacji mogą być przesyłane do wybranych baz danych, takich jak projekt bazy danych Rybosomalnych (RDP), GreenGenes i SILVA w celu identyfikacji i klasyfikacji. Powiązane sekwencje są” clustered ” i liczba przedstawicieli każdego klastra liczone. Klastry o podobnych sekwencjach określane są jako „operational taxonomic units” (OTUs). Liczby OTU są podsumowane w tabeli względnej obfitości dla każdego organizmu w każdej próbce., Do tej pory opracowano kilka rurociągów analitycznych do analizy danych sekwencji genów 16S rRNA, a dwa powszechnie stosowane rurociągi to QIIME i Mothur. QIIME pobiera użytkowników z ich surowych wyników sekwencjonowania poprzez wstępne analizy, takie jak wybieranie OTU, przypisanie taksonomiczne i budowę drzew filogenetycznych z reprezentatywnych sekwencji OTUs, a także poprzez późniejszą analizę statystyczną, wizualizację i produkcję Grafiki o jakości publikacji.,
LC Sciences oferuje kompleksową usługę sekwencjonowania genów 16srrna do identyfikacji i klasyfikacji gatunków w próbkach drobnoustrojów. Stosujemy strategię wzmocnienia fragmentu fragmentu 16S rDNA, sekwencję na wiodącej w branży platformie Illumina MiSeq i zapewniamy obszerną analizę danych, w tym: sekwencjonowanie statystyk wyjściowych danych, grupowanie sekwencji w operacyjne jednostki taksonomiczne (OTU), analizę różnorodności, klasyfikację gatunków i analizę obfitości.,
Ostatnio jeden z klientów LC Sciences zastosował sekwencjonowanie genu 16S rRNA do badania propagacji drobnoustrojów powietrznych w zanieczyszczonych obszarach, gdzie niekorzystne warunki pogodowe powodują podwójne zanieczyszczenie pyłem i smogiem.