linie komórkowe
linia komórkowa HEK 293T została uzyskana z kolekcji American type Culture Collection (ATCC CRL-3216). Linie komórkowe myszy hybridoma KT13 i KT22 zostały uzyskane w badaniach rozwojowych Hybridoma Bank (DSHB). Obie linie komórkowe zostały zdeponowane do DSHB przez Kazumasę Takedę i Asako Sugimoto (produkty dshb HYBRIDOMA KT13 i KT22)., Linia komórkowa myszy hybridoma 5E4/1F1 została udostępniona przez Miha Kosmača i Vladka Čurina Šerbca (Uniwersytet w Lublanie). Komórki HEK 293t i hybridoma były hodowane w DMEM (Gibco) uzupełnione o 13% FBS (Gibco), 1× penicylinę/streptomycynę (Thermo Fisher) i 1× GlutaMAX (Gibco). Sekwencje przeciwciał HC i LC z poszczególnych hybrydomaków oznaczano metodą odwrotnej transkrypcji reakcji łańcuchowej polimerazy (RT-PCR) i sekwencjonowania kapilarnego (genomika Eurofins).,
obróbka Cykloheksymidu i przygotowanie mikrosomów
wszystkie etapy pipetowania przeprowadzono na lodzie, a wirowanie przeprowadzono w temperaturze 4 °C za pomocą wirówki Eppendorf 5810r z wirnikiem o stałym kącie F-45-30-11. W celu zminimalizowania adhezji komórek do ścianek rurek zastosowano Protein LoBind 1,5 mL (Eppendorf). Komórki HEK 293T (1 milion), mysie komórki hybridoma (1 milion komórek 5E4, KT13 i KT22 wymieszanych w stosunku 1:1:1), komórki białaczkowe ARH-77 (ATCC CRL-1621, 1 milion) lub świeżo wyizolowane ludzkie komórki CD19 + B z próbek szczepień przed i po TD-booster (1.,5 milionów każda) wymieszano w 1 mL PBS z 50 µg/mL cykloheksymidu i inkubowano przez 10 minut, aby zatrzymać rybosomy z towarzyszącymi RNA (mRNA) w chropowatym retikulum endoplazmatycznym. Komórki granulowano 300 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i wymieszano pipetowaniem 15× w górę i w dół w 120 µL buforu do lizy o wysokiej gęstości (25 mm HEPES-KOH pH 7,2, 110 mm octan potasu, 5 mM octan magnezu, 1 mm EGTA, 25% sacharoza , 5% glicerol, 1 mM 1,4-ditiotreitol, 1× kompletny koktajl inhibitora proteazy wolnego od EDTA , 0,1 mg/mL cykloheksymid, 0,015% digitoniny i 400 j./ml inhibitora RNazy rybolokowej)., Lizę komórek i organelli zakończono inkubacją przez 10 minut na lodzie. Każdy homogenit został podzielony na dwie 55 µL alikwotów i przeniesiony do dwóch świeżych probówek z Lobindem białkowym. Probówki odwirowywano w temperaturze 600 g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C do granulowania jąder i resztek komórek. W sumie 40 µL supernatantu z każdej probówki, zawierającego frakcje membranowe i cytozol, przeniesiono do świeżych probówek z Lobindami białkowymi, a stężenie sacharozy rozcieńczono do 0,37–0,40 M (12-13% M/w) przez dodanie 40 µL wody wolnej od nukleaz. Mikrosomy następnie sedymentowano przez odwirowanie 20 800 g przez 120 min w temperaturze 4 °C., Supernatanty zawierające cytozol odrzucono, a granulki membranowe wymieszano pipetowaniem 10× w górę i w dół w 85 µL buforu myjącego (25 mm HEPES-KOH pH 7,2, 110 mm octan potasu, 2,5 mm octan magnezu, 1 mm EGTA, 1 mM 1,4-ditiotreitol, 1× kompletny koktajl inhibitora proteazy wolnego od EDTA, 0,1 mg/mL cykloheksymid, 0,004% digitonina i 400 j./ml Rnaza Rybolocka inhibitor). Mikrosomy ponownie sedymentowano przez odwirowanie 20 800 g przez 60 minut w temperaturze 4 °C., Supernatanty zostały odrzucone, a granulki mikrosomów ponownie zawieszono w 20 µL buforu myjącego i trzymano w lodzie do czasu dalszego użycia.
transmisyjna mikroskopia elektronowa
próbki po 3,5 µL ponownie zawieszonych mikrosomów HEK 293T naniesiono na świeżo wyładowane blaskiem siatki Quantifoil (Quantifoil, Niemcy) pokryte dodatkową warstwą nośną węgla o długości 2 nm i zamrożone w ciekłym etanie przy użyciu tłoka Vitrobot (Fei). Próbki były obrazowane za pomocą mikroskopu elektronowego Tecnai Spirit transmission (FEI) o napięciu 120 kV wyposażonego w kamerę CCD Eagle 2 × 2 K (Fei)., Mikrografy zostały zarejestrowane w warunkach małej dawki krio przy nominalnym powiększeniu 42 000× (rozmiar piksela w skali obiektu: 5,2 Å/px), stosując defokus od − 2 do − 4 µm. Gromadzenie danych było wykonywane ręcznie lub w pełni automatycznie za pomocą Leginon .
montaż emulsji RT-PCR za pomocą mikrosomów mysich hybridoma
rozcieńczyliśmy 16 µL ponownie zawieszonych mikrosomów z mieszanych hybridomas 5E4, KT13 i KT22 w 184 µL mieszanki master RT-PCR zawierającej 1× Verso 1-Step RT-PCR Master mix (Thermo Scientific), 1× Verso enzyme mix (Thermo Scientific), 0.,5 µg / µL BSA, 100 µg/mL cykloheksymidu i podkładów do odwrotnej transkrypcji oraz montażu HC i LC (po 0,8 µM każdy z podkładów TitA_MID1_IgM_rev i TitB_MID12_IgK_rev; po 0,16 µM każdy z podkładów oe_mhv_fwd i OE_MKV_fwd). Sekwencje podkładu przedstawiono w pliku dodatkowym 1: Rysunek S1a. uzyskane 200 µL roztworu wodnego wykorzystano do wytworzenia emulsji woda w oleju poprzez kroplowy dodatek (13 alikwotów po 15 µL w odstępach 30-s) do 800 µL fazy olejowej zgodnie z GE i in. (Olej mineralny, Sigma M5904, z 4,5% Span 80, Sigma S6760, 0,4% Tween 80, Sigma P8074 i 0.,05% Triton X-100, Sigma T8787) podczas ciągłego mieszania na mieszadle magnetycznym., Sześć podwielokrotności po 100 µL każdej uzyskanej emulsji przeniesiono do probówek PCR i poddano termocyklingowi w następujących warunkach: odwrotna transkrypcja w 50 °C przez 15 min, inaktywacja Rtazy w 95 °C przez 2 min, następnie cztery cykle denaturacji w 95 °C przez 20 s, wyżarzanie w temperaturze od 60 °C do 50 °C przez 50 s i przedłużanie w temperaturze 72 °C przez 1 min, następnie 16 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 20 s, wyżarzanie w temperaturze od 60 °C do 50 °C przez 1 min, 60 °C przez 30 s i przedłużanie w temperaturze 72 ° C przez 1 Min, a następnie końcowy etap przedłużania w temperaturze 72 ° C przez 5 min., Równolegle przeprowadzono otwartą kontrolę RT-PCR, rozcieńczając 4 µL ponownie zawieszonych mikrosomów w 46 µL mieszanki master RT-PCR i termocyklując reakcję równolegle z emulsją RT-PCR. Produkty PCR assembly ekstrahowano z emulsji za pomocą izobutanolu (2-metylo-1-propanol, Sigma) i zestawu Zymo DNA Clean & koncentrator-5 (Zymo Research), jak wcześniej opublikowano . Uzyskane DNA i produkt PCR z otwartej kontroli PCR zostały załadowane na 1,2% żelu TBE-agarozowego i oddzielone 90 V przez 60 min., Produkty montażowe o wielkości 800-950 bp zostały dobrane z żelu agarozowego, a produkty zostały odzyskane za pomocą zestawu do odzyskiwania ZYMOCLEAN GEL DNA. Produkty montażowe eluowano w 6 mM Tris-Cl pH 8 i przechowywano w temperaturze − 20 °C do dalszej analizy.,
nested PCR amplification of mouse hybridoma assembly products
Po reakcji montażu emulsji produkty montażowe zostały dodatkowo wzmocnione za pomocą podkładów adapterowych TitA_fwd, 5′ CGT ATC GCC TCC CTC GCG CCA TCA G 3′, oraz TitB_rev, 5′ CTA TGC GCC TTG CCA GCC CGC TCA G 3′, przy użyciu zestawu Phusion high-fidelity DNA polymerase kit (Finnzymes) z następującymi warunki termocyklingu: wstępna denaturacja w temperaturze 98 °C przez 30 S, następnie 15 cykli denaturacji w temperaturze 98 °C przez 7 s i wyżarzanie/przedłużanie w temperaturze 72 °C przez 30 s, a następnie końcowy etap przedłużania w temperaturze 72 °C przez 5 min., Produkty PCR zostały oczyszczone za pomocą zestawu Zymo DNA Clean & koncentrator-5. Parowanie HC i LC w produktach montażowych zostało następnie przeanalizowane przez PCR przy użyciu zagnieżdżonych podkładów specyficznych dla trzech różnych HC i trzech różnych LC (plik dodatkowy 1: Rysunek S1e) przy użyciu zestawu polimerazy DNA o wysokiej wierności Phusion z następującymi warunkami termocyklingu: wstępna denaturacja w temperaturze 98 °C przez 30 s, następnie 24 cykle denaturacji w temperaturze 98 °C przez 7 s I wyżarzanie/przedłużanie w temperaturze 72 °C przez 30 s, a następnie końcowy etap rozszerzenia w temperaturze 72 °C przez 5 min., Zagnieżdżone produkty PCR ładowano na 1,2% żelu TBE-agarozowego i oddzielano 90 V przez 40 min. W czasie rzeczywistym zagnieżdżony PCR do oznaczania ilościowego zanieczyszczenia krzyżowego przeprowadzono w triplikatach z tymi samymi zagnieżdżonymi podkładami przy użyciu SYBRGreen master mix (Applied Biosystems) na StepOne qPCR cycler (Applied Biosystems) w następujących warunkach termocyklingu: wstępna denaturacja w temperaturze 95 °C przez 10 min, następnie 40 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 15 s, wyżarzanie w temperaturze 56 °C przez 30 s i przedłużanie w temperaturze 72 °C przez 45 s., Początkowe wartości produktów montażu wzmocnionego zostały obliczone przy użyciu metody 2^(-deltaCt) i wykreślone jako wykresy słupkowe z paskami błędów pokazującymi odchylenie standardowe od średniej.
szczepienie i izolacja komórek CD19+ B z obwodowych próbek krwi pełnej
próbki krwi pełnej u ludzi wykorzystane w tym badaniu zostały pobrane z in.vent Diagnostica GmbH jako produkty uboczne z rutynowych procedur diagnostycznych. do środka.,vent Diagnostica GmbH ma pisemną świadomą zgodę darczyńcy na wykorzystanie produktów ubocznych do badań i posiada etyczną zgodę Międzynarodowej Komisji Etyki we Fryburgu (Kodeks FEKI 011/1763) na dystrybucję próbek. Zdrowy proband przeszedł szczepienie przypominające Toksoidem tężcowym (TT)/Toksoidem Diptheria (DT) (Td-PUR®; 20 jednostek międzynarodowych TT i 2 IU DT; Novartis, Basel, Szwajcaria)., K2-EDTA krwi obwodowej pełnej pochodzącej z uodpornienia wstępnego (dzień 0) i siedem dni po uodpornieniu uzupełniającym TD zostały wykorzystane do wyizolowania komórek CD19 + B za pomocą zestawu do separacji komórek PLURIBEAD CD19 (pluriSelect GmbH, Lipsk, Niemcy) zgodnie z protokołem producenta. Izolowane granulki komórek CD19 + B przemywano w 1 mL zimnego PBS i odwirowywano w 300 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. granulki komórek odpowiadające 1,5 mln komórek B z próbek przed i po immunizacji były przechowywane w lodzie do czasu leczenia cykloheksymidem i przygotowania mikrosomu.,
montaż emulsji RT-PCR przy użyciu mikrosomów ludzkich komórek B
dodaliśmy 2 µL rozcieńczonych mikrosomów przygotowanych z zamrożonych komórek ARH-77 (jako wewnętrzna kontrola parowania) do 26 µL ponownie zawieszonych mikrosomów z komórek B zarówno przed, jak i po szczepieniu Td, tak, że ostateczna frakcja mikrosomów ARH – 77 wynosi 0,5% (v/v). Rozcieńczyliśmy 16 µL tej zawiesiny mikrosomów w 184 µL RT-PCR master mix zawierający 1 × dART 1-step RT-PCR Master buffer mix( Robotklon), 2× dART Master enzyme mix (Robotklon), 0.,5 µg / µL BSA, 100 µg/mL cykloheksymidu i podkładów do odwrotnej transkrypcji (IgM, IgG i IgK) oraz zespołu ciężkich (VH) i lekkich łańcuchów (VK). Sekwencje i stężenia podkładu w RT-PCR Master mix są wymienione w dodatkowym pliku 1: Tabela S2., Uzyskane 200 µL roztworu wodnego wykorzystano do wytworzenia emulsji woda w oleju przez kroplowy dodatek (13 podwielokrotności po 15 µL w odstępach 30 s) do 800 µL fazy olejowej składającej się z 73% składnika emulsji 1, 7% składnika emulsji 2 i 20% składnika emulsji 3 zestawu do oczyszczania i oczyszczania Micelulowego DNA (Robotlon) podczas ciągłego mieszania za pomocą mieszadła magnetycznego., Sześć podwielokrotności po 100 µL każdej uzyskanej emulsji przeniesiono do probówek PCR i poddano termocyklingowi w następujących warunkach: odwrotna transkrypcja w 55 °C przez 30 min, wstępna denaturacja w 95 °C przez 3 min, następnie trzy cykle denaturacji w 95 °C przez 20 s, wyżarzanie w 56 °C przez 30 s i przedłużanie w 72 °C przez 2 min, następnie 20 cykli denaturacji w 95 °C przez 20 s, wyżarzanie w 56 °C przez 30 s S i przedłużeniem w temperaturze 72 °C przez 4 minuty, a następnie końcowym etapem przedłużania w temperaturze 72 °C przez 5 minut., Produkty PCR assembly ekstrahowano z emulsji za pomocą izobutanolu (2-metylo-1-propanol, Sigma) i zestawu Zymo DNA Clean & koncentrator-5 (Zymo Research), jak wcześniej opublikowano . Powstałe DNAs ładowano na 1% żelu agarozowego TBE i oddzielano 100 V przez 45 min. Produkty montażowe o wartości 700-800 bp zostały wybrane z żelu agarozowego, odzyskane za pomocą zestawu do odzyskiwania DNA Zymoclean Gel, eluowane w 6 mM tris-Cl pH 8 i przechowywane w temperaturze − 20 °C do dalszej analizy.,
zagnieżdżone PCR amplification of Human B cell Assembly products
dla konkretnych dalszych amplifikacji HC-LC Assembly products, zagnieżdżone PCR amplification was executive with zagnieżdżone primers specific for IgM, IgG, and IGK constant regions (Additional file 1: Table S2). Reakcja PCR zawierała zagnieżdżone podkłady w stężeniach 0,4 µM, 200 µM mieszanki dNTP, 1 × bufor reakcyjny Q5 i 0,02 U / µL Wysokiej Jakości polimerazy DNA Q5 (New England Biolabs) w objętości reakcji 50 µL z 3 µL zmontowanego DNA., Zagnieżdżone wzmocnienie PCR przeprowadzono w następujących warunkach termocyklingu: wstępna denaturacja w temperaturze 98 °C przez 3 min, następnie 34 cykle denaturacji w temperaturze 98 °C przez 30 s I wyżarzanie/przedłużanie w temperaturze 71 °C przez 1 min, a następnie końcowy etap przedłużania w temperaturze 72 °C przez 5 min. Próbki pobrano po trzech różnych numerach cyklu PCR (28, 31 i 34 cykle). Wzmocnione produkty PCR ładowano na 1% żeli TBE-agarozowych i oddzielano 100 V przez 60 min., Pożądane produkty ~ 710 bp zostały wyodrębnione, jak opisano powyżej, biblioteki sekwencjonowania zostały przygotowane zgodnie z przewodnikiem przygotowania próbki DNA Illumina TruSeq i 2 × 250 podstawowych odczytów sparowanych-końcowych zostały uporządkowane przy użyciu platformy Illumina MiSeq.
Analiza Bioinformatyczna sparowanych przeciwciał ciężkich i lekkich repertoires łańcucha
Demultipleksowanie 2 × 250 podstawowych sparowanych odczytów z platformy sekwencjonowania MiSeq przeprowadzono na podstawie indeksów adaptera, a dane sekwencjonowania uzyskano w formacie fastq., Tylko odczyty z minimalnymi wynikami jakości Phred wynoszącymi 10 ponad 50% wszystkich nukleotydów zostało zatrzymanych i skanowanych pod kątem sekwencji stałych IgM, IgG i IgK. Pary odczytu pozbawione stałych sekwencji regionu lub wykazujące strukturę HC-HC lub LC-LC zostały odfiltrowane, a pozostałe odczyty zostały przekonwertowane do formatu fastq i użyte jako dane wejściowe do analizy z MiXCR (v1.2)do wyrównania odczytów do sekwencji genów V(D) J I C z bazy danych IMGT , ekstrakcji i klastrowania nukleotydu CDR-H3 (dodatkowy plik 1: Tabela S1)., Sekwencje HC-CDR3 zawierające frameshift lub kodony stop i z mniej niż dwoma odczytami zostały odfiltrowane. Stworzyliśmy plik statystyk parowania HC-LC, aby zademonstrować sparowane użycie genu VH-VK w łącznym sparowanym repertuarze genów HC-LC. Mapy ciepła zostały wygenerowane za pomocą R i graficznie wyświetlone za pomocą ggplot2. Następnie zidentyfikowano międzyosobnicze sekwencje HC-CDR3 specyficzne dla TT, porównując sekwencje aminokwasowe HC-CDR3 uzyskane z próbki szczepienia uzupełniającego po TD z wcześniej opisanymi sekwencjami HC-CDR3 specyficznymi dla TT .,
PCR amplification of full-length HC and LC sequences
opracowaliśmy dwustopniową metodę amplifikacji opartą na PCR (dodatkowy plik 1: Rysunek S5) w celu włączenia miejsc trawienia restrykcyjnego do potencjalnie specyficznych dla TT HC i LC z kompletną sekwencją genu V(D)J. Umożliwiło to skuteczne klonowanie sekwencji HC i LC do odpowiednich wektorów ekspresji, a także produkcję rekombinowanych przeciwciał do badań wiązania in vitro., Krótko, wybraliśmy 14 sparowanych klonotypów HC – LC CDR3 uzyskanych z sekwencjonowania IgG po szczepieniu uzupełniającym TD na podstawie ich częstotliwości, dokładności parowania i różnicy między top1 LC-CDR3 i top2 LC-CDR3 sparowanymi z daną sekwencją HC-CDR3. Wyekstrahowaliśmy całkowity RNA z zamrożonych komórek B wyizolowanych z immunizacji po TD za pomocą odczynnika Trizolowego (Ambion), zgodnie z instrukcjami producenta. W pierwszym etapie wzmocnienie RT-PCR dla każdego wybranego klonotypu HC – I LC-CDR3 przeprowadzono oddzielnie za pomocą zestawu dART 1-step RT-PCR kit (Robotlon)., RT-PCR master mix (25 µL) zawierała pierwszorzędowe primery HC i LC V Specyficzne dla genów z nawisami ograniczającymi BssHII wraz z indywidualnymi, specyficznymi dla CDR3, odwrotnymi primerami z 18 nukleotydami regionu FR4 w stężeniach 0,4 µM (dodatkowy plik 1: Tabela S3 i rysunek S5), 1 × dART 1-step RT-PCR Master buffer mix, 1× dART Master enzyme mix i 4,5 ng całkowitego RNA., Warunki termocyklingu były następujące: odwrotna transkrypcja w 55 °C przez 30 min, wstępna denaturacja w 95 °C przez 3 min, następnie 23 cykle denaturacji w 95 °C przez 20 s, wyżarzanie w 56 °C przez 30 s i przedłużanie w 72 °C przez 90 s, następnie końcowy etap przedłużania w 72 °C przez 5 min. Produkty RT – PCR oczyszczono za pomocą zestawu do oczyszczania Agencourt AMPure XP-PCR (Beckman Coulter) zgodnie z instrukcjami producenta i eluowano w 6 mM tris-CL pH 8.0., W drugim etapie oczyszczone produkty RT-PCR zostały użyte jako szablon do amplifikacji PCR przy użyciu wysokiej jakości polimerazy DNA Q5 (New England Biolabs). Zagnieżdżona mieszanka główna PCR (50 µL) zawierała prekursory kodujące miejsce restrykcji BssHII i trzy nukleotydy sekwencji genów germinalnych HC lub LC wraz z odwrotnymi primerami zawierającymi kompletny region FR4 i nawisy restrykcji Nhei / HindIII w stężeniach 0,4 µM( dodatkowy plik 1: Tabela S3 i rysunek S5), 4 µL oczyszczonego DNA, 200 µM mieszanki dNTP, bufor reakcji 1× Q5 i 0.,02 U / µL Q5 high-fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs). Warunki termocyklingu przedstawiały się następująco: wstępna denaturacja w 98 °C przez 3 min, następnie 16 cykli denaturacji w 98 °C przez 30 s, wyżarzanie w 69 °C przez 30 s i przedłużanie w 72 °C przez 1 min, następnie końcowy etap przedłużania w 72 °C przez 5 min. Produkty PCR zostały oddzielone na żelu TBE-agarozowym, amplikony HC I LC o Pełnej długości z ograniczonymi miejscami trawienia zostały wyekstrahowane z żelu za pomocą zestawu do odzyskiwania żelu ZYMOCLEAN GEL DNA Recovery Kit (Zymo Research), a produkty były przechowywane w temperaturze − 20 °C do dalszego użycia.,
klonowanie i ekspresja rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych
trawienie restrykcyjne płytek HC i LC o Pełnej długości oraz wektorów ekspresji (pCMV-CD30-4IE3_HC i pCMV-CD30-4IE3_LC) przeprowadzono za pomocą enzymów restrykcyjnych BssHII, NheI i HindIII (New England Biolabs). Uzyskane produkty zostały załadowane na 2% TBE-żele agarozowe, a taśmy o wielkości ~ 5,9 kb dla szkieletu wektora HC, 5,3 kb dla szkieletu wektora LC, ~ 370 bp dla płytek HC i ~ 340 bp dla płytek LC zostały dobrane na żele agarozowe i oczyszczone zgodnie z powyższym opisem., Ligacje odpowiednich wkładek i wektorów dla amplifikowanych KLONOTYPÓW HC i LC przeprowadzono przy użyciu natychmiastowej lepkiej ligazy DNA (New England Biolabs) i przekształcono w jednowarstwowe chemicznie właściwe komórki E. coli TOP10 (IBA) zgodnie z instrukcjami producenta. Plazmid DNAs wyizolowano z przekształconych Kolonii (8-16 Kolonii) za pomocą qiaprep Spin miniprep kit( Qiagen); podobieństwa do sekwencji konsensusu potwierdzono za pomocą sekwencjonowania kapilarnego Sangera., Sekwencje DNA plazmidu HC i LC, które pasowały do sekwencji zgodnych z konsensusem, zostały przetransferowane do ludzkich komórek embrionalnych nerki linii HEK 293 t (ATCC, CRL-11268). Komórki T HEK 293 hodowano przy użyciu bogatej glukozy (4,5 g/L D-glukozy) zmodyfikowanej pożywki Dulbecco Eagle ' s (Gibco BRL) uzupełnionej inaktywowaną termicznie surowicą bydlęcą o ultra niskim IgG (Thermo Fisher Scientific), 100 U/mL penicyliny i 100 µg/mL streptomycyny. Oczyszczony plazmid DNAs dla sparowanych KLONOTYPÓW HC i LC został przetransferowany do 85-95% limfocytów T HEK 293 za pomocą Pei (polyethyleneamine, Polysciences)., Po czterech dniach od przetoczenia pobrano supernatanty hodowlane, a klonotypy specyficzne dla antygenu TT zidentyfikowano metodą testu pośredniego ELISA.
testy immunosorbentów enzymatycznych (ELISA)
przeprowadziliśmy testy ELISA pośredniego w celu identyfikacji mAbs pochodzących z uodpornionego probandu wiążącego się z antygenem TT przy użyciu transfekcyjnych supernatantów hodowli komórkowej. Nunc-Immuno MicroWell 96-płytki stałe (Thermo Fisher Scientific) zostały pokryte 100 µL antygenu TT 10 µg/mL (Statens Surum Institute, Kopenhaga, Dania)W 50 mM buforze węglanowym pH 9.,6, inkubowany przez noc w temperaturze 4 °C, trzykrotnie przemyty PBS i zablokowany 2% beztłuszczowym mlekiem w proszku (Bio-Rad) w PBS przez 150 minut w temperaturze pokojowej. Po zablokowaniu do studzienek dodano 120 µL rozcieńczonych w stosunku 1:2 przetoczonych supernatantów w PTM (PBS, 0,1% Tween-20, 2% beztłuszczowego mleka w proszku), 350 ng mysich anty-tt mAb (GeneTex) nałożono na jedną studnię jako kontrolę pozytywną, a płytki inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Płyty były trzykrotnie myte PBS-T (0.,1% Tween-20) i 50 µL rozcieńczenia 1:2000 wtórnego przeciwciała Kappa kappa LC-HRP (Thermo Fisher Scientific), 50 µL rozcieńczenia 1:2000 wtórnego przeciwciała Kappa IgG HC-HRP (Sigma #A0168) dodano do studni kontroli pozytywnej, płytki inkubowano przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i trzykrotnie przemyto PBS-T. dla rozwoju koloru dodaliśmy 50 µL jednoetapowego przeciwciała ultradźwiękowego IgG HC-HRP (Sigma # A0168). substrat TMB-Elisa (Thermo Fisher Scientific) na studnię, inkubował płytki przez 5 minut w temperaturze pokojowej i zatrzymał reakcję wiązania AG:AB przez dodanie 50 µl 2 m H2SO4., Absorbancję mierzono przy 450 nm przy użyciu systemu GloMax Multi Detection System (Promega). Testy ELISA dla wszystkich klonotypów przeprowadzono w triplikatach, wartości znormalizowano w celu usunięcia sygnałów tła, a błędy przedstawiono jako odchylenia standardowe od średniej.
Analiza powstawania amplikonów chimerycznych podczas zagnieżdżania PCR
cztery zdefiniowane amplikony HC-LC zostały wygenerowane przez wzmocnienie HC i LC z odpowiednich plazmidów pCMV (patrz wyżej) i wykorzystanie reakcji montażu PCR do wygenerowania czterech różnych zespołów HC-LC., HC i LC plazmid DNAs zostały użyte jako szablony do amplifikacji PCR par łańcuchów klonalnych Top1, Top2, Top3 i Top4 przy użyciu podkładów specyficznych dla odpowiednich rodzin genów VH i VK oraz stałych regionów IgG i IgK (dodatkowy plik 1: Tabela S2 i rysunek S6a). Oczyszczony plazmid DNA (10 ng) dodawano do każdej 25 µL reakcji PCR zawierającej 0,4 µM każdego podkładu, 200 µM mieszanki dNTP, 1× Q5 bufora reakcyjnego i 0,2 U/µL Q5 wysokiej jakości polimerazy DNA., Cykl termiczny przeprowadzono z wstępną denaturacją w temperaturze 98 °C przez 3 minuty, następnie 25 cykli denaturacji w temperaturze 98 °C przez 30 s, wyżarzaniem/przedłużeniem w temperaturze 71 °C przez 1 minutę (dla plazmidu HC DNA) lub wyżarzaniem w temperaturze 64 °C przez 1 minutę i przedłużeniem w temperaturze 72 °C przez 1 minutę (dla plazmidu LC DNA), a następnie końcowym etapem przedłużania w temperaturze 72 °C przez 5 minut. Produkty PCR ładowano na oddzielne żele 1% TBE-agarozowe i oddzielano 100 V przez 60 min. Pożądane produkty DNA o wartości ~ 400 bp (dla HC) i ~ 350 bp (dla LC) zostały wyselekcjonowane i wyekstrahowane z żelu, jak opisano powyżej., Oczyszczone produkty HC I LC PCR były używane jako szablony do montażu HC i LC przez rozszerzenie nakładania PCR (dodatkowy plik 1: Rysunek S6b). Krótko mówiąc, 5 ng każdego HC i odpowiadającego mu sparowanego DNA LC dodano do każdej 50 µL reakcji PCR zawierającej 1× 1-stopniowy bufor główny RT-PCR dART (Roboklon), 2× główny enzym dART (Roboklon) i 0,4 µM każdego podkładu stałego IgG i IgK (dodatkowy plik 1: Tabela S2)., Cykl termiczny przeprowadzono z inaktywacją RT w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, następnie trzy cykle denaturacji w temperaturze 95 °C przez 20 s, wyżarzanie w temperaturze 56 °C przez 30 s i przedłużanie w temperaturze 72 °C przez 2 minuty, następnie 25 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 20 s, wyżarzanie w temperaturze 56 °C przez 30 s i przedłużanie w temperaturze 72 °C przez 4 minuty, a następnie końcowy etap przedłużania w temperaturze 72 °C przez 5 minut. Produkty montażowe ładowano na 1% żeli TBE-agarozowych i oddzielano 100 V przez 45 min. Produkty montażowe o wartości ~ 750 bp zostały dobrane wielkościowo i wyekstrahowane z żelu agarozowego, jak opisano powyżej., Indywidualnie zmontowane pary klonów HC-LC zostały połączone i użyte jako szablon dla zagnieżdżonego wzmocnienia PCR z podkładami specyficznymi dla regionów stałych IgG i IgK (dodatkowy plik 1: Tabela S2, rysunek S6c). Zagnieżdżone reakcje PCR i warunki cyklu termicznego były takie same jak opisane w sekcji „zagnieżdżone PCR amplification of human B cell assembly products”, z wyjątkiem tego, że amplifikacja PCR została przeprowadzona przez 25 cykli. Produkty PCR ładowano na 1% żeli TBE-agarozowych, oddzielano 100 V przez 60 min, a pożądane produkty o wartości ~ 720 bp ekstrahowano zgodnie z powyższym opisem., Biblioteki sekwencjonowania z poszczególnych zestawów i z zestawów mieszanych po zagnieżdżonym PCR zostały przygotowane zgodnie z przewodnikiem przygotowania próbki DNA Illumina TruSeq i 2 × 250 podstawowych sparowanych odczytów końcowych zostały wygenerowane przy użyciu platformy Illumina MiSeq.