wykrywanie Pneumocystis jiroveci w próbkach oddechowych za pomocą czterech metod barwienia

Pneumocystis jiroveci, wcześniej znany jako Pneumocystis carinii, pozostaje ważną przyczyną zapalenia płuc u pacjentów z obniżoną odpornością, chociaż zakażenia tym lekiem zmniejszyły się po powszechnym zastosowaniu wysoce aktywnej terapii przeciwretrowirusowej (highly active antiretroviral therapy, HAART) w zakażeniu ludzkim wirusem niedoboru odporności (HIV) (9, 12). Pacjenci z obniżoną odpornością z powodów innych niż zakażenie HIV są również narażeni na zapalenie płuc spowodowane przez P., jiroveci, w tym pacjenci z nowotworami hematologicznymi oraz pacjenci otrzymujący leki immunosupresyjne stosowane w leczeniu chorób autoimmunologicznych (2, 11, 12).

chociaż do wykrywania P. jiroveci opracowano różne testy amplifikacji kwasów nukleinowych, w tym testy PCR w czasie rzeczywistym, testy te nie są powszechne w większości klinicznych laboratoriów mikrobiologicznych i nie są dostępne komercyjnie (3, 5). Dlatego główna laboratoryjna metoda wykrywania P., jiroveci, organizm, który nie może być uprawiany standardowymi metodami, jest bezpośrednim wzrokowym badaniem próbki klinicznej po pewnym rodzaju metodzie barwienia (12). Różne histochemiczne plamy zostały wykorzystane do wykrywania Pneumocystis w próbkach klinicznych. Te histochemiczne plamy obejmują diff-Quik, Grocott-Gomori Methenamine silver (GMS) i Calcofluor White plamy. Plama Diff-Quik jest modyfikacją plamy Wrighta (3). Plama GMS jest plama wytrącania srebra powszechnie stosowane do wizualizacji grzybów w sekcji histologicznych (10)., Biała plama Calcofluor jest fluorescencyjną plamą, której aktywnym składnikiem jest cellufluor, który niespecyficznie wiąże się z polisacharydami Beta, takimi jak chityna i celuloza, i jest stosowany do bezpośredniej wizualizacji grzybów w okazach klinicznych (4). Plamy immunofluorescencyjne, które wykorzystują przeciwciała skierowane przeciwko P. jiroveci, są również dostępne do bezpośredniego wykrywania tego organizmu w próbkach klinicznych (3, 5). Plamy te są podobne do bezpośrednich i pośrednich plam immunofluorescencyjnych stosowanych do wykrywania wirusów w próbkach klinicznych., Każda plama ma swoich zwolenników; dane porównawcze w erze HAART są ograniczone.

w związku z tym przeprowadziliśmy wieloinstytucjonalną ocenę czterech powszechnie stosowanych metod barwienia do bezpośredniego wykrywania P. jiroveci w klinicznych próbkach oddechowych. Szkiełka z badanych próbek dróg oddechowych, z których większość stanowiły próbki płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, zostały przygotowane przy użyciu cytocentryfugacji. Rozmazy replikacyjne 313 próbek układu oddechowego zgłoszonych do badania P. jiroveci zostały zbadane na obecność P. jiroveci z białkiem Calcofluor (Fungifluor; Polysciences, Inc.,, Warington, Pa.), GMS, Diff-Quik (Baxter Scientific, McGraw Park, Ill.), oraz Merifluor Pneumocystis (Meridian Bioscience, Inc., Cincinnati, Ohio). Szkiełka zostały poplamione Plamami Merifluor Pneumocystis i Diff-Quik zgodnie z instrukcjami producenta. W przypadku barwienia białym Kalkofluorem do każdego szkiełka Dodano 1 kroplę fluoru Fungifluoru, nakładano osłonkę tak, aby odczynnik pokrył cały obszar zawierający próbkę, a szkiełko pozostawiono na co najmniej 10 minut w ciemnej komorze wilgotności w temperaturze pokojowej przed interpretacją za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego., W przypadku barwienia metodą GMS, szkiełka były mikrofal przez 40 s W 10% roztworze kwasu chromowego, przemyte wodą, a następnie oczyszczone z 1% metabisiarczynu sodu przez 30 s. po przemyciu szkiełek wodą destylowaną, zostały umieszczone w słoiku Coplin zawierającym 50,0 ml roztworu roboczego methenaminy i mikrofal przez kolejne 65 s., Szkiełka przepłukano ponownie wodą destylowaną, oczyszczono 1% chlorkiem złota przez 2 do 5 s, przepłukano wodą destylowaną, wystawiono na działanie 5% tiosiarczanu sodu przez 1 min, przykryto jasnozielonym roztworem roboczym, oczyszczono ksylenem, pokryto pokrywami i zbadano rutynową mikroskopią świetlną.

każde z laboratoriów z czterech uczestniczących instytucji wykonało jeden z różnych bejc i dokonało ich interpretacji w oparciu o tę metodę bejcowania., Osoby w każdej instytucji miały doświadczenie z metodą barwienia wykonywaną tam i interpretacją plamienia. Próbki otrzymały unikalne kody identyfikacyjne, a każda plama była badana niezależnie, bez wiedzy o wyniku uzyskanym inną metodą barwienia na tej samej próbce., Ilość próbek rzadko była niewystarczająca do wykonania wszystkich czterech szkiełek; dostępnych było 308 szkiełek do barwienia białkiem Calcofluor, 310 szkiełek do barwienia Pneumocystis Merifluor, 307 szkiełek do barwienia Diff-Quik, a 310 szkiełek do barwienia GMS. W żadnym z przypadków, w których szkiełko było niedostępne z powodu niewystarczającej ilości próbki, Kategoryzacja tej próbki jako prawdziwej pozytywnej lub prawdziwej negatywnej (patrz poniżej) nie zależała od wyniku nieobecnego szkiełka.,

czułość, swoistość oraz dodatnie i ujemne wartości predykcyjne zostały obliczone metodami standardowymi (Tabela 1). Proporcje wyników prawdziwie-pozytywnych i fałszywie-pozytywnych dla testów sparowanych porównano z testem chi-kwadrat przy użyciu oprogramowania statystycznego EpiCalc 2000 (www.brixtonhealth.com/epicalc.html).

chociaż bardziej pozytywne próbki zostały wykryte przez plamę Merifluor Pneumocystis, liczba ta nie różniła się znacząco od tych wykrytych przez plamę Calcofluor white (P = 0,260) i GMS (P = 0,343)., Podobnie, liczba prawdziwych pozytywów wykrytych przez GMS i białe plamy Kalkofluorowe nie różniła się znacząco (P = 0,838) od siebie. Jednak liczba prawdziwych pozytywów wykrytych przez plamę Diff-Quik była znacznie mniejsza niż w przypadku plam Merifluor Pneumocystis (P = 0,002), GMS (P = 0,027) i Calcofluor white (P = 0,042). Liczba fałszywych alarmów nie różniła się znacząco pomiędzy plamami Calcofluor white, GMS i diff-Quik (każde porównanie miało wartość P >0.05)., Liczba fałszywie dodatnich wyników zgłoszonych po barwieniu plamą Merifluor Pneumocystis była jednak znacznie większa niż po barwieniu GMS( P = 0,004), Calcofluor white (P = 0,001) lub Diff-Quik (P = 0,001).

w niektórych przypadkach próbka wywołana plwociną może być pierwszą próbką otrzymaną do oceny obecności Pneumocystis w badaniu diagnostycznym pacjenta z zapaleniem płuc podejrzanym o wywołanie tego organizmu (6)., Jeśli wywołane plwociny próbki nie daje czynnik etiologiczny zapalenia płuc, następnie próbki z płukania oskrzelowo-płucnego, co jest znacznie bardziej kosztowne i niesie niewielkie ryzyko dla pacjenta, może być potrzebne do uzyskania materiału diagnostycznego., Ze względu na różnice w leczeniu zapalenia płuc wywołanego przez Pneumocystis w porównaniu z zapaleniem płuc wywołanym przez inne mikroorganizmy oraz możliwą potrzebę bronchoskopii, która wiąże się z dodatkowymi kosztami i ryzykiem dla pacjenta, w przypadku braku diagnozy ważne jest, aby do wykrycia tego organizmu zastosować najlepszą możliwą metodę barwienia.,

ponadto znaczenie czułej i specyficznej metody barwienia w erze HAART jest szczególnie ważne, ponieważ mniejsza częstość występowania zapalenia płuc wywołanego przez Pneumocystis niekorzystnie wpływa na dodatnią wartość prognostyczną każdego testu, który ma swoistość mniejszą niż 100% (9). Chociaż częstość występowania zapalenia płuc wywołanego przez Pneumocystis jest inna w erze HAART niż w erze przed HAART, wybór optymalnej metody barwienia w celu wykrycia Pneumocystis jest również ważny dla pacjentów z innymi schorzeniami obniżającymi odporność, którzy są zagrożeni zakażeniem., W rzeczywistości wybór optymalnej metody barwienia może być ważniejszy dla wykrycia Pneumocystis u pacjentów z obniżoną odpornością niezakażonych HIV, ponieważ wykazano, że próbki dróg oddechowych od tych pacjentów mają mniejsze obciążenie organizmów niż u pacjentów z obniżoną odpornością zakażonych HIV (6).

z naszego doświadczenia wynika, że plama Diff-Quik nie była skutecznym środkiem przesiewania na obecność P. jiroveci (tj. metodą barwienia podstawowego) ze względu na niską czułość i ujemną wartość prognostyczną tej plamy. Znacznie więcej okazów zawierających P., produkt jiroveci pominięto metodą Diff-Quika niż w przypadku Calcofluor white, Merifluor Pneumocystis i GMS. Raab i in. należy również opisać zarówno niską czułość (68%), jak i niską swoistość (88%), gdy sama plama Diff-Quik została użyta do wykrywania Pneumocystis i innych grzybów w próbkach płukania oskrzelowo-płucnego (10). Wyniki te są jednak sprzeczne z wynikami innych grup, które zgłosiły, że metoda Diff-Quik była porównywalna z metodą barwienia metodą GMS w wykrywaniu Pneumocystis (7, 8)., Jedna z grup zgłosiła, że metoda Diff-Quik była bardziej wrażliwa niż białe wapno, bezpośrednie barwienie immunofluorescencyjne, a nawet PCR, ale wyniki te nie zostały potwierdzone (1).

natomiast plama Merifluor Pneumocystis była najbardziej czułą metodą barwienia i może okazać się przydatna jako ekran do wykluczenia obecności Pneumocystis, ale była to najmniej specyficzna metoda w tym badaniu. Jednak liczba fałszywie dodatnich wyników w przypadku plam Merifluor Pneumocystis była znacznie większa niż w przypadku każdej z pozostałych plam., Plama Merifluor Pneumocystis miała dodatnią wartość prognostyczną wynoszącą tylko 81,9%, w porównaniu z pozostałymi trzema metodami, z których wszystkie miały dodatnią wartość prognostyczną większą niż 96%. Ng i wsp. opisały również pozornie fałszywie dodatnie wyniki za pomocą tej metody barwienia (8). Dlatego sugerujemy, że jeśli Merifluor Pneumocystis jest stosowany jako podstawowa metoda barwienia w klinicznym laboratorium mikrobiologicznym, należy potwierdzić drugą metodą, aby zwiększyć swoistość i dodatnią wartość prognostyczną końcowego wyniku testu.,

czułość zarówno plam wapniowo-białych, jak i plam GMS była pośrednia pomiędzy plamami Diff-Quik i Merifluor Pneumocystis, ale były one wysoce specyficzne i miały dodatnie wartości prognostyczne powyżej 96% i ujemne wartości prognostyczne powyżej 93%. Fraire et al. opisali również plamy Calcofluor white i GMS jako porównywalne w wykrywaniu Pneumocystis, z 92,6% zgodnością (4). Baughman i in., (1a) także opisywać czułość pośredni immunofluorescent niwecznik plama który jest skierowany w kierunku Pneumocystis i lepszy w czułości porównywać z zmodyfikowanym Wrighta plama i GMS plama, ale donosić na pojedynczy fałszywie dodatni wynik i tym samym dużo wyższy swoistość niż my opisywać. Możliwe, że dzięki dodatkowej praktyce łatwiej byłoby rozpoznać formy patognomoniczne za pomocą plamy Diff-Quika, zwiększając tym samym czułość tego testu., Podobnie, być może z dodatkowym doświadczeniem z Merifluor Pneumocystis plama, można nauczyć się lepiej rozróżniać między prawdziwe i fałszywie dodatnie plamy i tym samym zmniejszyć liczbę fałszywie dodatnie wyniki.

z naszego doświadczenia wynika, że plamy Calcofluor white i GMS mają najlepsze parametry do rutynowego stosowania w laboratorium klinicznym. Chociaż te testy były mniej czułe niż test immunofluorescencyjny, były one wysoce specyficzne i miały więcej niż dopuszczalne pozytywne i negatywne wartości predykcyjne.,

• Copyright © 2004 American Society for Microbiology