GLP-1 și secreția de insulină
Prezentare generală a căii sensibile la ATP.
secreția de insulină stimulată de glucoză (GSIS) este reglată de o serie de căi de semnalizare ionice și neionice, cunoscute și sub denumirea de căi dependente și independente KATP (34,35). Mecanismul dependent de KATP al cuplării stimul-secreție este revizuit în Fig. 1., În general, celula β adaptează secreția de insulină la nivelurile predominante ale glicemiei prin metabolismul glucozei. Când nivelurile de glucoză cresc, rata de glicoliză crește, ceea ce generează substraturi (în principal piruvat) pentru metabolismul oxidativ mitocondrial, rezultatul căruia este generarea de ATP sau, mai corect, o creștere a raportului ATP-ADP (36). Acest eveniment asigură legătura funcțională dintre un stimul de glucoză și secreția de insulină., Creșterea acestui raport determină închiderea celulelor β canalele KATP, ceea ce duce la depolarizarea membranei plasmatice, activarea de tensiune dependente de Ca2+ canale (VDCCs), și o creștere a concentrației intracelulare de Ca2+ (i), principalul declanșator pentru secreția de insulină. Repolarizarea celulelor β este probabil mediată de canalele K+ (Kv) dependente de tensiune și de canalele K+(KCa) sensibile la tensiune Ca2+ (37), care se deschid ca răspuns la depolarizarea membranei induse de glucoză pentru a restabili fluxul exterior al K+., Se propune ca GLP-1 să moduleze GSIS prin reglarea activității mai multor canale ionice implicate în secreția de insulină dependentă de KATP, precum și prin modularea etapelor distal-canal.
GLP-1 și canalele katp cu celule β.
unul dintre numeroasele efecte celulare observate ale GLP-1 este inhibarea canalelor katp cu celule β (38-40). Rezultate depolarizarea membranei induse de închiderea canalului KATP inițiază Ca2+ aflux prin VDCCs și declanșează exocytotic eliberarea de insulina., Figura 2 prezinta efect excitator de GLP-1 pe potențialul de membrană și efectul său inhibitor asupra atât nativ canalului KATP curenți de la INS-1 celule și curenți mediată de recombinare canalele KATP (SUR1/Kir6.2) coexpressed cu receptorilor GLP-1 într-o linie de celule de mamifer. Consecintele fiziologice ale GLP-1-a facilitat închiderea canalului KATP-ar fi să-1) crește excitabilitate a celulelor deja peste pragul de eliberare a insulinei și 2) de a crește procentul de β-în mod activ celulele secretoare de insulină la concentrațiile glucozei în mod normal subthreshold pentru eliberarea de insulină.,
consensul este că efectul inhibitor al GLP-1 asupra canalelor KATP este dependent de cAMP/PKA (38-41), deși un studiu care utilizează celule β de șobolan nu este de acord (42). Această afirmație a lui Suga și colab. (42) se bazează pe constatarea lor că inhibitorul specific PKA Rp-cAMPS (100 µmol/l) nu a putut preveni depolarizarea celulară și reducerea curentului KATP cu celule întregi provocat de GLP-1. Completitudinea inhibării PKA de către Rp-cAMPS ar trebui pusă la îndoială deoarece, în același studiu, forskolin a indus o secreție semnificativă de insulină chiar și în prezența Rp-cAMPS. În al doilea rând, Suga și colab., sugerează că GLP-1 provoacă o ușoară creștere în ATP sensibilitatea canalului KATP astfel că la low micromolare ATP concentrații, KATP canal va fi mai sensibile la închidere. Cu toate acestea, în condiții normale de șobolan pancreatice β-celulare, millimolar nivelurile de ATP sunt prezente (43), iar la aceste fiziologice nivelurile de ATP, foarte similar canalului KATP deschide probabilitate (Po) în absența și în prezența de GLP-1 sunt estimate după cum urmează. Calculele noastre indică faptul că, cu un intracelular de 2 mmol/l, canalul KATP Po este redus de la 0,005 la 0,003 în prezența GLP-1., Este plauzibil ca o deplasare spre stânga a sensibilității ATP să aibă loc în prezența GLP-1. Cu toate acestea, magnitudinea observată a reducerii curentului KATP indus de GLP-1 observată în înregistrările cu cleme de patch-uri cu celule întregi (Fig. 2) este probabil prea mare pentru a fi contabilizată numai de scăderile mici ale Po calculate din datele Suga et al. (42). Lucrările recente din laboratorul nostru au arătat că inhibitorul PKA specific h-89 (44) care pătrunde în membrană este capabil să inhibe complet reducerea curentului KATP prin GLP-1 (45)., Mai mult, alții au arătat rezultate similare folosind Rp-8-br-cAMPS, un analog mai permeabil la membrană al Rp-cAMPS (38,41). Acțiunile de GLP-1 pe canalele KATP poate implica, de asemenea, alte căi de semnalizare pentru că canalului KATP inhibarea de GLP-1 în mouse-ul β-celule a fost demonstrat a fi calmodulin dependentă, folosind calmodulin inhibitori W-7 și calmidazolium (46).dependența de glucoză a acțiunilor GLP-1 a fost bine stabilită, deși mecanismele precise pentru această dependență sunt neclare (41,47)., Cu toate acestea, acțiunile celulare ale PKA pe canalul KATP pot oferi o legătură între această kinază și sensibilitatea la glucoză a GLP-1. Alte grupuri au arătat că adăugarea de subunitatea catalitică de PKA (cPKA) pentru a excizat patch-uri care conțin canalele KATP rezultatele într-o augmentare de KATP curent (39,48). Laboratorul nostru a arătat recent că efectul cPKA asupra curentului KATP depinde de ADP (45). Când nivelurile ADP sunt ridicate, cPKA crește curentul canalului KATP într-un sistem recombinant, în concordanță cu rezultatele Lin et al. (39)., În schimb, pe măsură ce nivelurile ADP scad, cPKA reduce curentul KATP (45). Din punct de vedere fiziologic, acest lucru poate duce la un accesoriu neglijabil de β-celulare excitabilitate atunci cand nivelurile de glucoza sunt mici (de mare ), întrucât, atunci când nivelul glucozei crește (scăzută ), GLP-1 mediată de închidere de la canalele KATP, printr-un PKA-dependente cale, duce la depolarizarea membranei și ulterior crește în β-excitabilității celulare., O atenție deosebită trebuie acordată raportului ATP-ADP celular atunci când se ia în considerare activitatea canalului KATP, deoarece modificările acestui raport, mai mult decât modificările intracelulare per Se, sunt cele care guvernează activitatea canalelor KATP în celula β intactă. ATP-ul liber este puternic tamponat în interiorul celulei de atpazele membranare și citosolice (43) și se preconizează că nu se va modifica semnificativ odată cu creșterea metabolismului glucozei (36). În schimb, schimbarea reciprocă a ADP, care nu este tamponată în aceeași măsură, este mai semnificativă și are ca rezultat o modificare a raportului ATP-ADP (36)., Într-adevăr, importanța ADP în controlul celulelor β canalului KATP activitate s-a demonstrat că mutațiile în ADP-sensing regiune a omului canalului KATP duce la necontrolată secreția de insulină și hipoglicemie (49). Identitatea moleculară a sitului(siturilor) de fosforilare PKA are o importanță semnificativă și este încă în curs de investigare. Ambele Kir6.,2 și SUR1 subunități ale canalului KATP conține prezumtiv secvențe țintă pentru PKA mediate de fosforilare (39,48), și sistematice mutație de aceste reziduuri ar trebui să clarifice contribuțiile relative ale acestor site-uri la acțiunea de PKA pe canalului KATP.
GLP-1, VDCCs și magazine intracelulare Ca2+.
GLP-1 s–a dovedit a spori curenții prin VDCCs în celulele β de șoarece, șobolan și uman (38,50-52), deși magnitudinea acestui efect variază și adesea nu atinge semnificație statistică., În celulele β umane unice, s-a demonstrat că GLP-1 crește activitatea vdcc de tip L și amplitudinea tranzienților intracelulari de calciu evocați de depolarizare, efect care a reprezentat 40% din creșterea EXOCITOZEI potențate de GLP-1 (52). Deși L-tip VDCCs clasic sunt considerate ca majore de reglementare de Ca2+ aflux ceea ce duce la secreția de insulină, β-celule sunt cunoscute pentru a exprima mai multe Ca2+ canal izoforme (53). Pereverzev și colab. (54) a raportat recent că șoarecii care nu au izoforma A1E a Cav2.3 au redus toleranța la glucoză și au diminuat răspunsurile la insulină la glucoză., Ei speculează că reglarea proteinei G a acestui canal poate modula secreția de insulină pe baza reglării receptorilor muscarinici de acetilcolină a VDCCs in vitro (55).am descoperit în celulele insulinomului HIT-T15 transfectate cu receptorul GLP-1 că GLP-1 determină o creștere a curenților Ca2+ dependenți de tensiune (vezi 56 și Fig. 3a). Acest lucru se datorează, cel puțin parțial, să o spre stânga shift în dependența de tensiune de activare amintesc de efectul de VDCC fosforilarea de PKA (57,58)., Am observat, de asemenea, o schimbare spre dreapta a dependenței de tensiune a inactivării la starea de echilibru, astfel încât, în prezența GLP-1, mai puține canale au fost inactivate efectiv la un anumit potențial de menținere (50). Acest lucru este susținut de Britsch et al. (50), OMS sugerează că tratamentul GLP-1 al celulelor β de șoarece încetinește inactivarea curenților Ca2+ dependenți de tensiune. În plus, GLP-1 a dus la o creștere a calciului intracelular numai după adăugarea glucozei, efect care a fost blocat parțial de antagoniștii VDCC (Fig. 3c)., Capacitatea GLP-1 de a spori curenții Ca2+ este, ca și efectul asupra canalelor KATP, dependentă de cAMP (51,52), bazată pe capacitatea Rp-cAMPS de a preveni o creștere a curenților. Într-adevăr, tratamentul celulelor β de șobolan cu dibutiril ciclic-AMP, un analog cAMP permeabil la membrană, a replicat efectul GLP-1 asupra curenților Ca2+ (51)., În plus, în studiile noastre (56), VDCC răspuns la GLP-1 a fost pierdut în HIT-T15 celule care exprimă un mutant receptorilor GLP-1 lipsite de critică reziduurile necesare pentru cuplarea la adenylyl ciclaza, întrucât VDCC activitate ar putea fi încă îmbunătățită prin tabără independent agonist BAYK8644. Dovezi recente sugerează că un O-kinaza ancorare proteine (AKAP), AKAP18, obiective PKA să VDCCs și că aceasta kinaza poate fi implicată în GLP-1 modulație de aceste canale (59).,
În plus față de efectele asupra VDCCs, GLP-1 poate mobiliza intracelulare de calciu magazine într-o tabără manieră dependentă (60,61), eventual contribuind la oscilatorie am răspuns la GLP-1 văzut în HIT-T15 celule (Fig. 3c) (62). Studiile noastre sugerează că aplicarea GLP – 1 are ca rezultat oscilații în i în celulele HIT-T15 și că aceste oscilații nu sunt eliminate (deși sunt diminuate în amplitudine) prin îndepărtarea Ca2+ extracelular sau prin blocarea VDCC (Fig. 3c)., Într-adevăr, într-o serie de tipuri de celule, oscilațiile Ca2+ induse de un agonist sunt cauzate în primul rând de eliberarea Ca2+ prin trisphosphate inozitol (IP3) și/sau magazine sensibile la ryanodină (63-65). În β-celule, GLP-1 mobilizează Ca2+ magazine în mare parte prin sensibilizarea receptorilor ryanodine (probabil de tip 2 izoenzimei, RYR-2) la procesul de Ca2+indusă de Ca2+ eliberați (CICR) (61,66). Mai multe studii au demonstrat că GLP-1 poate crește i într-o manieră independentă de PKA (67-69)., Acest mecanism a fost recent atribuite CICR din ryanodine sensibile la magazine prin tabăra reglementate guanine nucleotide factor de schimb II (GEF-II sau Epac2) și interacțiunea acestuia cu Ras-legate mic G-proteine Rap1 sau cu Rab3 mici G-proteine efectoare Rim2 (68). Importanța taberei-GEF-II-Rim2 a fost demonstrată, deoarece inactivarea acest complex (de oligonucleotide antisens sau mutant constructe) atenuat secretoare de reacție a mouse-ului insule sau MIN6 insulinom celule pentru a GLP-1 (67)., Deoarece afinitatea cAMP pentru PKA este mult mai mare (∼100 nmol/l) comparativ cu cAMP-GEF-II (∼10 mmol/L), este interesant de speculat că calea camp-GEF-II stimulată de GLP-1 ar putea funcționa mai degrabă pe o creștere a taberei locale decât pe schimbări globale., Deși receptorilor GLP-1 semnalizare stimuleaza IP3 producție în receptorilor GLP-1-exprimarea COS celule (70), un rol pentru IP3-sensibile Ca2+ magazine la nivel mondial nu este pusă la îndoială, deoarece GLP-1-a stimulat IP3 producție, în principal β-celule este potrivit surselor minim (71,72) și IP3 antagonist al receptorilor xestospongin C nu a reușit să blocheze eliberarea intracelulară a Ca2+ magazine de forskolin tratament (68). Cu toate acestea, eliberarea Ca2+ reglementată de IP3 din granule de insulină a fost sugerată de studiile Nakagaki et al., (62), OMS sugerează că GLP-1 poate regla în mod unic eliberarea temporală și spațială a calciului intracelular prin semnalizarea IP3 locală. Astfel, eliberarea mediată de GLP-1 a depozitelor intracelulare, împreună cu potențarea intrării Ca2+ prin VDCCs, contribuie probabil la efectul insulinotrop al GLP-1.
GLP-1 și canalele kV cu celule β.
curenții k+ dependenți de tensiune, cum ar fi cei mediați de canalele Kv sau KCa, mediază repolarizarea celulelor β după un stimul depolarizant, cum ar fi glucoza (37)., Recent, am raportat că canalele familiei Kv1 și Kv2 reglează secreția de insulină, deoarece knock-out funcțional dominant-negativ al oricăreia dintre aceste familii de canale îmbunătățite GSIS (73). Canalele Kv2.1 mediază majoritatea acestui efect (>60%), mecanismul căruia implică depolarizarea membranei stimulate de glucoză și intrarea Ca2+ (observații nepublicate). Deoarece curenții kV ai celulelor β sunt regulatori puternici dependenți de glucoză ai secreției de insulină, am emis ipoteza că secretagogii fiziologici, cum ar fi GLP-1, pot regla funcția canalului Kv., Într-adevăr, ne-am raporta în altă parte în acest supliment, care receptorul GLP-1 agonist exendin 4 inhibă voltaj-dependente pasivă a K+ curenți în șobolan β-celule tensiune-prinse în celulă întreagă de configurare de 40% și prelungește semnificativ durata de timp a celulelor β după repolarizare depolarizare tranzitorie prin injecție de curent. Aceasta se compară cu o reducere cu 86% a curenților k+ exteriori obținuți cu tetraetilamoniu, antagonist general al canalului Kv. GLP-1 antagonizează curenții k+ exteriori dependenți de tensiune în celulele β de șobolan în absența glucozei., Cu toate acestea, acest efect poate contribui în continuare la dependența de glucoză a efectului insulinotrop al GLP-1, deoarece canalele Kv nu sunt în mod normal așteptate să fie active decât după o depolarizare indusă de glucoză a membranei celulare (37). În plus, și similar cu efectul GLP-1 asupra celorlalte canale ionice menționate mai sus, inhibarea mediată de exendin 4 a canalelor kV cu celule β depinde de semnalizarea cAMP. Cu toate acestea, un studiu recent a sugerat că semnalizarea cAMP nu a fost suficientă în sine pentru a antagoniza curenții k+ dependenți de tensiune într-o linie celulară secretoare de insulină (INS-1) (74).,numeroase studii au descris efectele modificărilor mediate de hormoni în curenții k+ dependenți de tensiune, atât excitatori, cât și inhibitori. Cel mai bine caracterizat de aceste efecte este voltaj-dependente de K+ curent de downregulation în limfocite și suprareglarea în miocitele cardiace (75,76). În ambele țesuturi, calea de semnalizare cAMP/PKA a fost implicată în reglarea acestor canale (76,77)., Rapoartele sugerează că cAMP poate reduce curenții k+ dependenți de tensiune în limfocitele murine (76) și o linie celulară pituitară (78), dar poate spori curenții k+ dependenți de tensiune în miocitele cardiace (77), o constatare care a fost confirmată la nivelul unui singur canal în miocitele atriale de broască (79) și axonul calmar gigant (80)., Fosforilarea poate apărea direct pe canal, deoarece fosforilarea PKA a unui canal kV atrial în apropierea activității canalului îmbunătățit NH2-terminus (81) și fosforilarea subunităților α ale canalului Kv1 reglează gradul de inhibare a acestor canale conferite de o subunitate β de reglementare (82). Fosforilarea subunităților β în sine poate modula, de asemenea, interacțiunea de reglementare cu subunitățile α care formează pori (83). S-a demonstrat recent că reglarea unui canal Kv cardiac (KvLQT) de către cAMP necesită expresia AKAP15/18 sau AKAP79 (84)., În plus, o creștere a curentului k + dependent de tensiune este implicată în inhibarea indusă de epinefrină a creșterii dependente de glucoză a celulelor β ob/ob și +/+ de șoarece (85), deoarece efectul a fost inversat de tetraetilamoniu. Interesant este că efectul inhibitor al epinefrinei asupra i a fost inversat și de activatorul de adenilil ciclază forskolin (85). Prin urmare, credem că există dovezi care sugerează că modularea hormonală a curenților Kv este importantă din punct de vedere fiziologic. În mod specific, inhibarea GLP-1 a acestor curenți este de așteptat să conducă la o excitabilitate sporită a celulelor β.,
GLP-1 și alte canale ionice cu celule β.
creșterile cAMP intracelular sunt cunoscute de mult timp pentru a spori curenții Na+ (86), un efect care poate fi mediat prin fosforilarea canalelor directe de către PKA (87). Un răspuns Curent tranzitoriu Na+ la cAMP a fost descris pentru prima dată în neuronii gastropodelor și denumit ina(cAMP) (88)., În insulino-secretoare de celule, ARN expresie a cationic neselectiv gene mSTRPC4 și LTRPC2 a fost detectat recent în insulinom celule umane și insulițe, respectiv (89), iar tabara a fost raportat de a induce expresia genelor de mNSC1, care codifică un mouse nespecifice ficare canal (NSCC) (90). GLP-1 este considerat a spori un NSCC care transportă predominant na+ curenți (91,92). Acest efect are loc prin activarea de către GLP-1 a semnalizării cAMP și eliberarea depozitelor intracelulare Ca2+ și poate servi ca o altă cale modulatoare importantă pentru GLP-1 în celula β (40)., Nu este clar dacă NSCCs activat de GLP-1 corespund cationic neselectiv curent produs de activare a Ca2+-detectare receptor (93), dar acesta din urmă efect este raportat că nu implică activarea Gs subunitate și poate, prin urmare, nu implică taberei/PKA cale.este puțin cunoscut în ceea ce privește efectele GLP-1 asupra altor canale ionice. În celulele secretoare de insulină (94) au fost detectați curenți Cl activi în tumefierea celulelor, dar rolul acestor canale în secreția de insulină nu este clar., Canalele Cl, cum ar fi regulatorul conductanței transmembranare a fibrozei chistice și canalele Cl rectificatoare exterioare sunt activate prin semnalizarea cAMP/PKA (95). Dacă apare în celula β, acest efect ar tinde să promoveze depolarizarea. Un raport sugerează că GLP-1 activează un curent Cl sensibil la Ca2+în ovocitele Xenopus care exprimă receptorul GLP-1 (96), efect care a fost dependent de mobilizarea intracelulară Ca2+ dependentă de P3(1,4,5). Rămâne de stabilit, totuși, dacă GLP-1 poate stimula curenții Cl în celulele secretoare de insulină.
GLP-1 și exocitoză.,
glucoza poate exercita un efect stimulator asupra exocitozei insulinei, independent de acțiunile sale bine caracterizate inițiate de inhibarea canalelor KATP. Importanța acestei căi de metabolizare poate fi realizat prin faptul că șoarecii cu un perturbarea vizate în KATP (Kir 6.2 sau SUR1) nu se afișează evidente anomalii toleranței la glucoză (97,98). Secreția de insulină independentă de KATP nu este bine înțeleasă și se consideră că implică mai multe semnale care acționează asupra țintelor neionice, în special etapele distale ale exocitozei., S-a propus că metabolismul glucozei este necesar pentru acest efect stimulator și că semnalele probabile includ ATP, cAMP, glutamat și malonil-CoA (rev.în 99 și 100). Având în vedere că ATP, cAMP și PKA sunt implicate în procesul exocitotic, este plauzibil să credem că GLP-1 poate avea efecte distal față de acțiunile asupra canalelor ionice, sporind în continuare secreția de insulină. Este bine cunoscut faptul că acțiunile care suprimă acumularea cAMP indusă de GLP-1 și activarea PKA inhibă secreția de insulină, sugerând că cAMP și/sau PKA sunt efectorii plauzibili (101)., În celulele β de șoarece, doar o fracțiune de exocitoză poate fi contabilizată prin acțiuni de cuplare stimul-secreție (102). Din studiile care arată că cAMP induce secreția în prezența i scăzut și înalt, se sugerează că cAMP sensibilizează mașinile exocitotice. Studiile care utilizează cAMP fotoreleasable și inhibitorii PKA demonstrează că cAMP evocă efecte dependente de PKA și independente asupra exocitozei. Creșterile cAMP, independente de activarea PKA, par să accelereze exocitoza bazinului ușor eliberabil în celulele β (103)., Mobilizarea dependentă de PKA a granulelor secretoare, spre deosebire de generarea cAMP în sine, pare să necesite metabolismul glucozei (creșterea ATP/ADP) și implică translocarea granulelor (103,104). Un astfel de efect ar crește dimensiunea bazinului ușor de eliberat, ar crește rata de reaprovizionare a bazinului și ar spori exocitoza. Deoarece PGL-1 poate crește atât cAMP, cât și PKA, efectele asupra exocitozei pot fi implicate din aceste date., Există mai multe proteine țintă potențiale pentru acțiunile GLP-1, inclusiv proteinele receptorului proteinei de atașare (SNARE) solubile în celule β, sensibile la factorul n-etilmaleimid (105).
GLP-1 și homeostazia energiei intracelulare.
studii recente pe celule β clonale sugerează că acțiunile insulinotropice ale GLP-1 sunt parțial mediate de o stimulare dependentă de PKA a lipazei sensibile la hormoni (HSL) (106). Se propune ca acțiunile lipolitice ale GLP-1 să determine defalcarea trigiceridelor la acizii grași liberi din celulele β, care sunt apoi transformați în CoA cu lanț lung., O creștere a acizilor grași liberi ar putea furniza apoi substrat pentru oxidarea mitocondrială și producția de ATP, ducând la o creștere mai mare a raportului ATP-ADP intracelular și la inhibarea suplimentară a canalelor KATP. În plus, deoarece ATP poate influența el însuși exocitoza, unele dintre acțiunile GLP-1 pot fi de a viza etapele distale ale exocitozei, așa cum am menționat mai sus. S-a demonstrat în mai multe studii că ATP facilitează semnificativ exocitoza independentă de depolarizarea celulară, dar este dependentă de Ca2+ (99)., Astfel, un alt mecanism potențial ar putea explica secreția de insulină indusă de GLP-1.