ce este PCR? – Ghidul începătorului

PCR este tehnica laboratoarelor moderne de biologie moleculară. Dacă trebuie să copiați, să secvențiați sau să cuantificați ADN-ul, trebuie să știți PCR. Pe scurt, PCR (reacția în lanț a polimerazei) este o tehnică biochimică care folosește termociclul și enzimele pentru a copia rapid și fiabil ADN-ul și a fost inventată într-o clipă de inspirație de către un om de știință care conducea pe autostrada 128 de la San Francisco la Mendocino.,acest articol oferă o scurtă prezentare generală a PCR, cu câteva sfaturi pentru a vă ajuta să evitați cele mai frecvente capcane. Dacă sunteți nou, sau relativ nou la PCR, atunci acest lucru este pentru tine. (Și chiar dacă aveți experiență la PCR este bine în valoare de o citire pentru a reîmprospăta, și poate apuca un sfat sau două!).

ingrediente PCR de bază:

polimeraza

polimerazele sunt enzime care, în condițiile potrivite, pot asambla noi fire de ADN din ADN-ul șablon și nucleotide. Reacția inițială PCR a fost greoaie, deoarece temperaturile ridicate necesare denaturării ADN – ului ar ucide polimerazele., Acest lucru a însemnat că, după fiecare ciclu de încălzire, polimerazele noi trebuiau adăugate manual la reacție– un efort scump. Cu toate acestea, în moderne PCR acest lucru nu este o problemă, deoarece polimerazele utilizate în moderne PCR vin de obicei de la una dintre cele două bacterii termofile surse, Thermus aquaticus sau Pyrococcus furiosus. Aceste polimeraze, respectiv, Taq (pronunțat „tack”) și Pfu (pronunțat „P-F-U”) rezistă cu ușurință temperaturilor ridicate asociate unei reacții PCR., Polimerazele comerciale Taq și Pfu sunt proiectate pentru viteză, fidelitate, procesivitate (capacitatea de a completa citirile lungi) și capacitatea lor de a citi șabloane bogate în GC. Companiile vin în mod constant cu noi polimeraze. Prin urmare, nu vă mulțumiți cu „orice este în congelator”, ci faceți cumpărături pentru cea mai bună polimerază comercială pentru nevoile dvs. De asemenea, discutați cu reprezentantul dvs. local de vânzări, deoarece acestea pot da adesea mostre gratuite de polimerază, astfel încât să puteți decide ce este mai bine pentru dvs.

șablon ADN

acesta este ADN-ul pe care îl proiectați primerii., Este ADN-ul pe care polimeraza dvs. îl va citi și copia. ADN-ul dvs. șablon poate fi genomic, plasmid sau cDNA, dar indiferent de calitatea sursei dvs. contează. Cu cât ADN-ul șablonului este mai intact și mai pur, cu atât este mai ușor să obțineți rezultate PCR bune. De asemenea, rețineți că cantitatea ideală de ADN va depinde de sursa dvs., de obicei 1 PG – 1 ng de ADN plasmidic sau 1 ng – 1 µg de ADN genomic pe reacție PCR.

Primerii

Primerii sunt fragmente scurte de ADN sintetizat care se leagă de ADN-ul șablonului. Va trebui să proiectați un primer ” înainte „și un primer” invers”., Primerul dvs. înainte desemnează începutul PCR-ului. Secvența acestui primer este aceeași cu secvența ADN a șablonului 5-3. Grundul invers desemnează sfârșitul PCR-ului. Secvența acestui primer este complementul invers al ADN-ului șablonului. În general, grundurile au o lungime de 18-22 perechi de baze. Cu toate acestea, mai important decât lungimea lor este temperatura de topire a primerilor. Temperatura de topire a grundurilor dvs. trebuie să fie de 54-60°C și cât mai asemănătoare între ele., Există o mulțime de calculatoare online care pot calcula temperaturile de recoacere a grundului, iar majoritatea companiilor care sintetizează primerii furnizează astfel de calculatoare.ca monomeri ai ADN-ului, nucleotidele sunt necesare pentru a face copii ale ADN-ului. Pentru majoritatea PCR-urilor ADN, veți utiliza trifosfați de Deoxinucleozidici (dNTPs). Puteți cumpăra aceste separat sau ca un amestec dgtp, dCTP, dATP și dttp. Indiferent ce cumpărați, rețineți că nucleotidele sunt foarte sensibile la ciclurile de îngheț/dezgheț. Prin urmare, cel mai bine este de a crea întotdeauna alicote mici de dNTPs dumneavoastră., De asemenea, asigurați – vă că le depozitați corect-nu utilizați un congelator fără îngheț care trece prin cicluri automate de dezghețare.

tampon

majoritatea polimerazelor comerciale sunt furnizate cu tamponul lor ideal. Aceste tampoane nu numai că furnizează pH-ul corect, dar au întotdeauna aditivi precum magneziu, potasiu sau DMSO, care ajută la optimizarea activității de denaturare, renatare și polimerază a ADN-ului. Vor fi mai multe despre acești aditivi într-un articol viitor.

Termociclarea:

aici se întâmplă magia., Toate ingredientele de mai sus sunt adăugate la un tub PCR și tubul este termociclat. Pentru a realiza termociclarea atunci când PCR a fost inventat pentru prima dată tuburi PCR individuale au fost mutate manual între băi de apă încălzită. (Și credeți că munca dvs. de bancă este obositoare!) Acum, datorită invenției „Mr. Cycles”, prima mașină de termociclare, reglarea temperaturii se face acum automat de către termociclere. Următorul este un profil tipic de termociclu PCR:

inițializare

în această etapă reacția este încălzită la 94-96°C timp de 30 de secunde până la câteva minute., Acest pas se face de obicei o singură dată la începutul reacției PCR. Acest pas este important pentru activarea polimerazelor de pornire la cald, dacă utilizați o astfel de polimerază și pentru a denatura ADN-ul șablonului. Rețineți că, dacă conținutul GC al șablonului dvs. este ridicat, poate fi necesar să efectuați un pas de inițializare foarte lung.

denaturarea (repetată de 15-40 de ori)

în această etapă, reacția este încălzită la 94-98°C timp de 15-30 secunde. Acest pas denaturează ADN-ul și primerii, ceea ce le va permite să se recoacă reciproc în pasul următor.,

recoacere (repetată de 15-40 de ori)

în această etapă, temperatura reacției dvs. este redusă rapid la 50-64°C timp de 20-40 de secunde. Temperatura din această etapă trebuie să fie suficient de scăzută încât primerii denaturați să poată forma perechi de baze Watson-Crick cu ADN-ul șablonului. Dar suficient de mare încât să se poată forma doar cele mai stabile (perfect împerecheate) structuri ADN dublu catenare. De obicei, această temperatură perfectă de recoacere este cu câteva grade mai mică decât temperatura de topire a perechii de grunduri. De asemenea, în timpul acestei etape, polimeraza dvs. se va lega de complexul ADN primer/șablon., Deși polimeraza dvs. nu va începe să citească până când temperatura nu va crește în pasul următor.

Alungire sau Extensie (repetat de 15-40 ori)

În această etapă reacția ta este încălzită rapid la 72-80°C. Acest lucru este atunci când polimeraza va începe de lectură (în direcția 5-3) și copierea ADN șablon (în 3-5direction). Temperatura mai ridicată în timpul acestei etape reduce interacțiunile nespecifice ale primerului / șablonului ADN, crescând astfel specificitatea reacției dumneavoastră., Cu toate acestea, temperatura exactă va fi determinată de preferința polimerazei dvs., așa că citiți ambalajul. Durata acestei etape depinde de cât timp va fi copia ADN-ului. De obicei, ADN polimeraza poate copia 1.000 de perechi de baze pe minut. Prin urmare, trebuie să permiteți cel puțin 1 minut de prelungire la 1.000 de baze. La sfârșitul acestei incubări vor fi create noi bucăți de ADN dublu catenar, constând atât din șablon, cât și din ADN nou.

pasul 2-4 se repetă apoi de 15-40 de ori

este adevărat că cu cât programați mai multe cicluri, cu atât veți crea mai multe copii ADN., Cu toate acestea, există o limită superioară. La un moment dat nucleotidele libere disponibile devin limitative, iar copiile ADN trunchiate prematur pot deveni o problemă. Deci, nu te lacomi cu ciclismul tău. Mai puțin, dar bun produs PCR curat este de preferat la o mulțime de produse murdare.

alungirea finală

acesta este un pas opțional, dar adesea recomandat. În această etapă, reacția este menținută la 70-74°C timp de câteva minute. (De obicei, veți utiliza aceeași temperatură pe care ați folosit-o în etapa de alungire sau extensie.) Acest pas permite polimerazelor să termine citirea indiferent de firul în care se află în prezent., Acest pas opțional poate ajuta la reducerea numărului de copii trunchiate în produsul final.

hold Final

reacția dvs. este acum completă. Deoarece întregul proces poate dura câteva ore, reacțiile PCR se fac adesea peste noapte sau când ați renunțat altfel; este recomandat să programați termociclul să țină produsul PCR la 4°C până când vă întoarceți. Moment în care puteți analiza sau utiliza produsul dvs. sau îl puteți transfera într-un depozit mai adecvat pe termen lung, cum ar fi frigiderul.

mult noroc și PCR-ing fericit!