Detectarea de Pneumocystis jiroveci Respiratorii Specimene de Patru Metode de Colorare

ABSTRACT

Am examinat patru metode de colorare replica pe frotiuri de 313 respiratorii exemplare depuse pentru Pneumocystis jiroveci de examinare. Sensibilitatea și specificitatea petelor albe de Calcofluor (CW) au fost de 73,8 și, respectiv, 99,6%. Sensibilitatea și specificitatea petei de argint Grocott-Gomori methenamine (GMS) au fost de 79,4 și, respectiv, 99,2%., Sensibilitatea și specificitatea petei Diff-Quik au fost de 49,2 și, respectiv, 99,6%. Sensibilitatea și specificitatea petei Merifluor Pneumocystis au fost de 90,8 și, respectiv, 81,9%. Numai CW și GMS au avut valori predictive pozitive și negative ale > 90%.,Pneumocystis jiroveci, cunoscut anterior ca Pneumocystis carinii, rămâne o cauză importantă a pneumoniei la pacienții imunocompromiși, deși infecțiile cu acest medicament au scăzut după utilizarea pe scară largă a terapiei antiretrovirale foarte active (HAART) pentru infecția cu virusul imunodeficienței umane (HIV) (9, 12). Pacienții care sunt imunocompromiși din alte motive decât infecția cu HIV sunt, de asemenea, expuși riscului de pneumonie cauzată de P., jiroveci, inclusiv pacienții cu tumori maligne hematologice și cei care au primit medicamente imunosupresoare pentru tratamentul bolilor autoimune (2, 11, 12).deși o varietate de teste de amplificare a acidului nucleic, inclusiv teste PCR în timp real, au fost dezvoltate pentru detectarea P. jiroveci, aceste teste nu sunt obișnuite în majoritatea laboratoarelor de microbiologie clinică și nu sunt disponibile comercial (3, 5). Prin urmare, principala metodă de laborator pentru detectarea P., jiroveci, un organism care nu poate fi cultivat prin metode standard, este examinarea vizuală directă a specimenului clinic după un anumit tip de metodă de colorare (12). O varietate de pete histochimice au fost utilizate pentru a detecta Pneumocystis în probele clinice. Aceste pete histochimice includ Diff-Quik, Grocott-Gomori methenamine silver (GMS) și petele albe Calcofluor. Diff-Quik stain este o modificare a Wright stain (3). Pata GMS este o pată de precipitare argintie folosită în mod obișnuit pentru vizualizarea ciupercilor în secțiunile histologice (10)., Calcofluor alb pata este o pată fluorescentă, ingredientul activ care este cellufluor, care nespecific se leagă de beta-legate de polizaharide, cum ar fi chitină și celuloză, și este utilizat pentru vizualizarea directă a ciupercilor în probe clinice (4). Petele imunofluorescente, care utilizează anticorpi direcționați împotriva lui P. jiroveci, sunt de asemenea disponibile pentru detectarea directă a acestui organism în specimene clinice (3, 5). Aceste pete sunt similare cu petele imunofluorescente directe și indirecte utilizate pentru detectarea virusurilor în probele clinice., Fiecare pată are susținătorii săi; datele comparative din epoca HAART sunt limitate.prin urmare, am efectuat o evaluare multi-instituțională a patru metode de colorare utilizate în mod obișnuit pentru detectarea directă a P. jiroveci în probele respiratorii clinice. Lamelele din epruvetele respiratorii studiate, majoritatea fiind exemplare de lavaj bronhoalveolar, au fost preparate prin citocentrifugare. Frotiuri Replicate de 313 epruvete respiratorii prezentate pentru examenul P. jiroveci au fost examinate pentru prezența P. jiroveci cu Calcofluor alb (Fungifluor; Polysciences, Inc., Warington, Tată.), GMS, Diff-Quik (Baxter Scientific, McGraw Park, Ill.) și Merifluor Pneumocystis (Meridian Bioscience, Inc., Cincinnati, Ohio) pete. Diapozitivele au fost colorate cu pete Merifluor Pneumocystis și Diff-Quik conform instrucțiunilor producătorului. Pentru Calcofluor alb colorare, 1 picătură de Fungifluor a fost adăugat la fiecare slide, lamelă de acoperire a fost aplicat astfel încât reactiv acoperit întreaga specimen care conțin zonă, și glisați-a fost permis să stea timp de cel puțin 10 min într-un întuneric umiditatea camerei la temperatura camerei înainte de interpretare cu un microscop cu fluorescenta., Pentru colorarea GMS, lamelele au fost microunde timp de 40 s într-o soluție de acid cromic 10%, spălate cu apă și apoi curățate cu metabisulfit de sodiu 1% timp de 30 s. după ce lamelele au fost spălate cu apă distilată, au fost plasate într-un borcan Coplin conținând 50,0 ml soluție de lucru metenamină și microunde pentru încă 65 s., Slide-urile au fost clătite din nou cu apă distilată, tratat cu 1% clorură de aur de la 2 la 5 s, clătite cu apă distilată, expus la 5% tiosulfat de sodiu, timp de 1 min, counterstained cu o lumină verde soluție de lucru, eliminate în xilen, acoperite cu capac alunecă, și examinate de rutină microscopie optică.

fiecare dintre laboratoarele din cele patru instituții participante a efectuat una dintre diferitele pete și a redat interpretările lor pe baza acestei metode de colorare., Persoanele de la fiecare instituție au avut experiență cu metoda de colorare efectuată acolo și interpretarea petei. Exemplarele au primit coduri unice de identificare și fiecare pată a fost examinată independent, fără cunoașterea rezultatului obținut printr-o altă metodă de colorare pe același specimen., Cantitatea de specimen rar insuficiente pentru a face toate cele patru slide-uri; 308 slide-uri au fost disponibile pentru colorare cu Calcofluor alb, 310 slide-uri au fost disponibile pentru colorare cu Merifluor Pneumocystis, 307 slide-uri au fost disponibile pentru colorare cu Diff-Quik, și 310 slide-uri au fost disponibile pentru colorare cu GMS. În niciunul dintre cazurile în care un diapozitiv nu a fost disponibil din cauza unei cantități insuficiente de specimen, clasificarea specimenului respectiv ca adevărat pozitiv sau adevărat negativ (a se vedea mai jos) nu depinde de rezultatul diapozitivului absent.,sensibilitatea, specificitatea și valorile predictive pozitive și negative au fost calculate prin metode standard (Tabelul 1). Proporțiile adevărate-pozitive și fals-pozitive rezultate pentru asociat teste au fost comparate cu testul chi-pătrat folosind EpiCalc 2000 de software statistic (www.brixtonhealth.com/epicalc.html).

Deși mai adevărat-probe pozitive au fost detectate de către Merifluor Pneumocystis pata, acest număr nu a fost semnificativ diferite de cele identificate de Calcofluor alb (P = 0.260) și AGA (P = 0.343) petele., În mod similar, numărul de pozitive reale detectate de GMS și petele albe de Calcofluor nu au fost semnificativ diferite (P = 0.838) unele de altele. Cu toate acestea, numărul de pozitive reale detectate de petele Diff-Quik a fost semnificativ mai mic decât cele detectate de petele Merifluor Pneumocystis (P = 0,002), GMS (P = 0,027) și Calcofluor white (p = 0,042). Numărul de fals pozitive nu a fost semnificativ diferit între petele Calcofluor white, GMS și Diff-Quik (fiecare comparație a avut o valoare P >0.05)., Numărul de rezultate fals pozitive raportate după colorare cu Merifluor Pneumocystis pata, cu toate acestea, a fost semnificativ mai mari decât cele raportate după colorare cu GMS (P = 0.004), Calcofluor alb (P = 0,001), sau Diff-Quik (P = 0,001).în unele cazuri, o probă de spută indusă poate fi prima probă primită pentru evaluarea prezenței Pneumocystis în analiza diagnostică a unui pacient cu pneumonie suspectată a fi cauzată de acest organism (6)., Dacă o probă de spută indusă nu reușește să producă agentul etiologic al pneumoniei, atunci poate fi necesară o probă din lavaj bronhoalveolar, care este semnificativ mai costisitoare și prezintă un risc mic pentru pacient, pentru a obține material de diagnostic., Din cauza diferențelor în tratamentul de pneumonie cauzată de Pneumocystis contra pneumoniei cauzate de alte microorganisme și posibila nevoie pentru bronhoscopie, care suportă costuri suplimentare și risc pentru pacient, în cazul în care diagnosticul nu este stabilit, este important că cea mai bună metoda de colorare fi folosit pentru detectarea de acest organism.,mai mult, importanța unei metode de colorare sensibile și specifice în epoca HAART este deosebit de importantă, deoarece prevalența mai scăzută a pneumoniei cauzate de Pneumocystis afectează negativ valoarea predictivă pozitivă a oricărui test care are o specificitate mai mică de 100% (9). Deși prevalența pneumoniei cauzate de Pneumocystis este diferită în epoca HAART decât în epoca pre-HAART, alegerea metodei optime de colorare pentru detectarea Pneumocystis este, de asemenea, importantă pentru pacienții cu alte afecțiuni imunocompromise care prezintă risc de infecție., În fapt, alegerea optimă metoda de colorare poate fi mai important pentru detectarea de Pneumocystis în non-infectate cu HIV, pacienții imunocompromiși, deoarece s-a demonstrat că respiratorii exemplare din acești pacienți au o mai mică povară de organisme decât cele de la infectate cu HIV, pacienții imunocompromiși (6).din experiența noastră, pata Diff-Quik nu a fost un mijloc eficient de screening pentru prezența P. jiroveci (adică o metodă primară de colorare) din cauza sensibilității scăzute și a valorii predictive negative a acestei pete. În mod semnificativ mai multe exemplare care conțineau P., jiroveci au fost ratate prin metoda Diff-Quik decât cu Calcofluor white, Merifluor Pneumocystis și GMS. Raab și colab. descrieți, de asemenea, atât o sensibilitate scăzută (68%), cât și o specificitate scăzută (88%) atunci când singura pată Diff-Quik a fost utilizată pentru detectarea Pneumocystis și a altor ciuperci în probele de lavaj bronhoalveolar (10). Cu toate acestea, aceste constatări sunt în contrast cu cele ale altor grupuri, care au raportat că metoda Diff-Quik a fost comparabilă cu metoda de colorare GMS pentru detectarea Pneumocystis (7, 8)., Un grup a raportat că metoda Diff-Quik a fost mai sensibilă decât culoarea albă Calcofluor, colorarea imunofluorescentă directă și chiar PCR, dar aceste rezultate nu au fost coroborate (1).în schimb, pata Merifluor Pneumocystis a fost cea mai sensibilă metodă de colorare și se poate dovedi utilă ca ecran pentru a exclude prezența Pneumocystis, dar a fost cea mai puțin specifică metodă din acest studiu. Cu toate acestea, numărul de rezultate fals pozitive cu pata Merifluor Pneumocystis a fost semnificativ mai mare decât cel raportat pentru fiecare dintre celelalte pete., Pata Merifluor Pneumocystis a avut o valoare predictivă pozitivă de numai 81,9%, comparativ cu celelalte trei metode, toate având valori predictive pozitive mai mari de 96%. Ng și colab. au descris, de asemenea, rezultate aparent fals pozitive cu această metodă de colorare (8). Prin urmare, sugerăm că, dacă Merifluor Pneumocystis este utilizat ca metodă primară de colorare într-un laborator de microbiologie clinică, atunci trebuie efectuată confirmarea cu oa doua metodă pentru a crește specificitatea și valoarea predictivă pozitivă a rezultatului final al testului.,

sensibilitățile ambelor Calcofluor alb și AGA petele au fost intermediare între cele ale Diff-Quik și Merifluor Pneumocystis pete, dar acestea au fost foarte specifice și a avut valori predictive pozitive de mai sus 96% și predictivă negativă valori de peste 93%. Fraire și colab. au descris, de asemenea, petele de Calcofluor alb și GMS ca fiind comparabile pentru detectarea Pneumocystis, cu o concordanță de 92,6% (4). Baughman și colab., (1a) descrie, de asemenea, sensibilitatea unei pete indirecte de anticorpi imunofluorescenți care este îndreptată spre Pneumocystis și superioară în sensibilitate în comparație cu o pată Wright modificată și o pată GMS, dar au raportat un singur rezultat fals pozitiv și, prin urmare, o specificitate mult mai mare decât descriem. Este posibil ca, cu o practică suplimentară, să se recunoască mai ușor formele patognomonice cu pata Diff-Quik, crescând astfel sensibilitatea testului respectiv., În mod similar, poate cu un plus de experiență cu Merifluor Pneumocystis pata, s-ar putea afla la o mai bună discriminare între adevărat-pozitive și fals-pozitive colorare și, astfel, să diminueze numărul de rezultate fals-pozitive.din experiența noastră, petele Calcofluor white și GMS au cei mai buni parametri pentru utilizarea de rutină într-un laborator clinic. Deși aceste teste au fost mai puțin sensibile decât testul imunofluorescent, ele au fost foarte specifice și au avut valori predictive pozitive și negative mai mult decât acceptabile.,

• Copyright © 2004 American Society for Microbiology