” secvențierea ARN este o metodă de secvențiere de ultimă generație cu randament ridicat, utilizată pentru a analiza expresia genelor și studiile transcriptomice.”
acidul Ribonucleic este un tip de acid nucleic implicat major în expresia genelor, reglarea genelor și codarea/decodarea informațiilor. ARNm-ARN mesager este o secvență de codificare a unei gene implicate în sinteza proteinei, aproximativ 4% din Fondul de ARN este format din ARNm, în timp ce restul sunt ARN-uri care nu codifică., deși aproximativ 90% din ARN nu codifică, acestea sunt importante pentru îndeplinirea diferitelor funcții.
de exemplu,
- Tarn-transferă aminoacidul în situsul ribozomal, în timp ce traducerea.
- rRNA-ARN ribozomal ajută la traducere.
- microRNA-expresia genelor și reglarea expresiei genelor.
- siRNA-protejează o celulă de ARN-urile exogene.
un ARNm este un acid nucleic monocatenar transcris dintr-o genă și din care este tradusă proteina.,
ARNm sau transcrierea conține numai secvențele de codificare dintr-o genă. Astfel, are doar secvențele care sunt necesare în formarea proteinelor. de acum înainte, prin analizarea unui ARNm, se poate determina modelul de Expresie al genei înrudite. de asemenea, examinarea ARN totală ne oferă o idee despre genele care sunt legate de formarea proteinei și care nu sunt.
înseamnă că cantitatea de ARN total, ARNm și ncRNA poate fi determinată prin studierea ARN-ului total., Transcriptomica este studiul întregului ARNm – adesea numit ca transcriptomi sau ARN total prezent într-o celulă sau o populație de celule. prin analizarea transcriptomului unei celule, poate fi examinată întreaga piscină a expresiei genei. Una dintre tehnicile importante utilizate în studiile transcriptomice este secvențierea ARN. transcriptomul unui organism este mai mare, mai complex și mai incert, spre deosebire de genom. transcriptomul variază în condiții diferite și într-un mediu diferit., Stilul de viață, dieta, exercițiile fizice, mediul, Condițiile și alți factori externi joacă un rol semnificativ în reglementarea transcriptomelor.
aici, în secvențierea ARN, ADNc sintetizat din ARNm este secvențiat și cuantificat într-un sequencer. În prezentul articol, vom discuta despre secvențierea ARN numai, dar înainte de aceasta citiți articolul nostru anterior despre transcriptomică: ce este Transcriptomica?,
Subiecte-Cheie:
Principiul de secvențe de ARN:
secvențe de ARN este un urmatoarea generatie, cu randament sporit secvențe de ARN și metoda de cuantificare utilizat pentru studierea transcriptomics și expresia genelor. un ADNc este construit din ARNm total prin procesul de transcriere inversă și fragmentat. Simultan, adaptor ligation și biblioteca de pregătire sunt practicate înainte de a face secvențiere.
secvențiatorul citește și cuantifică ADNc complementar cu ARNm.,
Steps in RNA-seq:
- RNA isolation
- cDNA synthesis
- Adaptor ligation
- Library preparation
- DNA fragmentation
- Sequencing
- Downstream applications
RNA isolation:
The first step in the RNA sequencing is the isolation of total RNA, mRNA or ncRNA for the experiment.,
izolarea ARN este un proces obositor în comparație cu izolarea ADN-ului. ARN-ul poate fi defalcare cu ușurință. De asemenea, șansa de contaminare este ridicată în izolarea ARN. astfel, trebuie să aveți grijă deosebită în timp ce izolați ARN-ul și mâna expertă necesară pentru a face acest lucru.
ARN pur cu randament ridicat este necesar pentru secvențierea ARN. puritatea și cantitatea de ARN sunt măsurate folosind Nanodrop sau qubit.
Note: for isolating mRNA from the total RNA pool, one additional step is required, using the oligo dT specific column in the purification or final step of elution, total mRNA can be isolated from the rest of RNAs.
acum proba noastră de ARN este pregătită pentru pasul următor.,
Reverstranscriptaza PCR:
Un alt set inovator pentru secvențierea ARN-ului este de a face reverstranscriptaza PCR în care ARN-ul este transcris invers în ADN. folosind un tip special de polimerază cunoscut sub numele de ADN revers transcriptază, ADNc este sintetizat din ARNm.
Aflați mai multe despre RT PCR aici: reverstranscriptază PCR.
sinteza ADNc a doua catenă:
după ADNc sintetizată din ARNm, este necesară sinteza ADN a doua catenă. Pentru aceasta, PCR se efectuează utilizând ADN polimeraza Taq normală în PCR convențional.,
polimeraza adaugă dNTPs la firul ADN în creștere folosind setul de grunduri.
pregătirea Bibliotecii:
primul pas în pregătirea bibliotecii sau pregătirea bibliotecii NGS începe cu fragmentările.
folosind tipul special de endonucleaze de restricție întregul set de ADNc ds este fragmentat pentru NGS.
notă:
pregătirea bibliotecii variază de la platformă la platforme, deoarece unele fragmente ARNm înainte de a efectua revers transcriptaza, în timp ce unele o efectuează mai târziu după prepararea ADNc., în ultima etapă a pregătirii bibliotecii, capetele sunt ligate cu secvențele adaptorului și amplificate pentru repararea capetelor. da-tailing este opțională în cazul bibliotecii ARNm.
purificarea Bibliotecii:
întreaga bibliotecă este purificată folosind kitul de purificare ADN gata de utilizare. în ultima etapă, este foarte important să se purifice întreaga bibliotecă de fragmente pentru ca concentrația bibliotecii să fie evaluată folosind PCR cantitativ sau bioanalyzer., pentru un începător cred că pregătirea bibliotecii și fragmentarea ADN-ului este foarte greu de înțeles, deci credem că ar trebui să scriem un întreg articol despre fragmentarea ADN-ului Genomic, pregătirea bibliotecii și importanța acesteia în NGS.
oricum să mergem mai departe,
în pasul următor, proba de ADN fragmentat este trimisă pentru secvențiere.
secvențierea ADN:
acum, proba este secvențiată în mașina NGS cu randament ridicat, care citește secvența, precum și cuantifică și acidul nucleic., chimia din spatele secvențierii ADNc depinde de platformele pe care le folosim, deși metoda utilizată pe scară largă este utilizarea chimiei fluorescente.
în secvențiator, fragmentele individuale sunt „citite” separat și secvențiate. Datele finale sunt trimise la laboratorul de bioinformatică pentru analiza post-secvențiere.,
Different types of RNA and its function:
| Abbreviation | RNA types | Function |
| mRNA | Messenger RNA | Codes for protein |
| tRNA | Transfer RNA | Transfer amino acid to the site of translation., |
| rRNA | Ribosomal RNA | Catalyse the translation reaction |
| miRNA | microRNA | Gene regulation |
| siRNA | Smaller interfering RNA | Gene regulation and maintaining gene expression. |
| LncRNA | Long non-coding RNA | Transcriptional regulation and epigenetic regulations., |
| snRNA | Small nuclear RNA | Helps in mRNA splicing and related functions |
| snoRNA | Small nucleolar RNA | Helps in RNA nucleotide modification |
| piRNA | Piwi-intercalating RNA | Function in defence against transposon; transposon defence system. |
| scaRNA | Small Cajal body-specific RNA | Also helps in nucleotide modifications (a type of snoRNA)., |
| shRNA | ARN ac de păr mic | molecula de ARN sintetic ajută la reglarea genelor și la controlul expresiei genelor. |
Transcriptomului analiza datelor:
Una dintre cele mai plictisitoare locuri de muncă, după cum deja am discutat în articolul precedent este transcriptomului analiza datelor și interpretarea rezultatelor. Datele NGS sunt uriașe și mai complexe., sincer vorbind, analiza datelor de predare a transcriptomics nu este posibilă, ar trebui să ia practică hands-on pentru a învăța, totuși, voi încerca să te învăț ce urmează în acest proces. diferite fragmente sunt secvențiate în mașină și datele sunt colectate. În etapa următoare, pe baza regiunii de flancare a fragmentelor, așa-numitele „contings” sunt aranjate pentru a obține variante de îmbinare. în pasul următor, transcriptomul este comparat cu secvența de referință sau poate fi asamblat de novo.,
o scurtă trecere în revistă a întregului proces de ARN-seq.
Toată transcriptomului secvențiere:
tot transcriptomului de o celulă sau țesut – toate Arn (arnm, arnt, arnr, sncRNA, microarn-ul și arn-ul) sunt ordonate și cuantificate. Cu alte cuvinte, putem spune că atât romanul, cât și transcrierile cunoscute pot fi secvențiate.pentru a face acest lucru, întregul set de ARN este extras din proba de țesut.,
secvențierea ARN țintă:
un grup de transcriptomi specifici genei, specifici unei căi sau legați de boală sunt secvențiați în secvențierea ARN specifică țintă.
secvențierea ARN țintă este mai accesibilă și mai precisă decât secvențierea transcriptomului întreg. Mai mult, este necesară o cantitate mai mică de probă de ARN pentru efectuarea experimentului.
secvențierea ARN-ului mic:
una dintre cele mai emergente tehnici în secvențierea ARN-ului este de a studia ARN-ul mai mic care nu codifică o celulă, deoarece acestea sunt asociate cu atât de multe funcții într-un genom.,
moleculele de ARN mai mici, cum ar fi miRNA, siRNA și piRNA, pot fi cuantificate și secvențiate prin metoda de secvențiere ARN bazată pe NGS pentru diverse aplicații.
secvențierea ARNm:
Sequentează întreaga transcriere a ARNm folosind selecția Poli(a) a cozii utilizată pentru studiile de expresie a genelor. Folosind secvențierea ARNm cunoscută, precum și modificarea transcrierii noi pot fi detectate.
avantajele secvențierii ARN:
unul dintre avantajele pivot ale secvențierii ARN este lipsa informațiilor despre secvența anterioară., Deoarece întregul proces nu se bazează pe chimia bazată pe sondă, aici nu sunt necesare informații despre secvența anterioară pentru proiectarea sondei.
se poate face un studiu mai precis și mai sensibil al expresiei genelor.
interval dinamic mai larg.
capturați atât modificările cunoscute, cât și cele noi ale transcrierii, chiar dacă nu sunt disponibile informații despre secvență.
chiar dacă nu sunt disponibile informații despre secvența de referință, secvențierea ARN poate fi aplicată pentru orice specie.
înrudit: genomul sintetic-metode, aplicații și provocări.,
concluzie:
în mod concludent putem spune că metoda ARN seq este mai avansată și mai precisă în comparație cu microarray. De asemenea, mutațiile de novo pot fi descoperite și folosind-o.