linii Celulare
HEK 293T linie de celule au fost obținute de la American Type Culture Collection (ATCC CRL-3216). Mouse-ul de hibridoame linii celulare KT13 și KT22 au fost obținute din Studiile de Dezvoltare Hibridoame Banca (DSHB). Ambele linii celulare au fost depuse la DSHB de Kazumasa Takeda și Asako Sugimoto (DSHB hibridoame produse KT13 și KT22)., Mouse-ul de hibridoame linie de celule 5E4/1F1 a fost cu amabilitate furnizate de Miha Kosmač și Vladka Čurin Šerbec (Universitatea din Ljubljana). HEK 293T și de hibridoame celulele au fost cultivate în DMEM (Gibco) suplimentat cu 13% FBS (Gibco), 1× Penicilină/Streptomicină (Thermo Fisher), și 1× GlutaMAX (Gibco). Secvențele de anticorpi HC și LC din hibridomele individuale au fost determinate prin reacția în lanț a polimerazei cu transcripție inversă (RT-PCR) și secvențierea capilară (Eurofins Genomics).,
Cycloheximide tratament și microsome pregătire
Toate pipetarea pași au fost efectuate pe gheață și centrifugations au fost efectuate la 4 °C, folosind un Eppendorf 5810R centrifugă cu unghi fix rotor F-45-30-11. Tuburile de centrifugă Protein LoBind 1,5 mL (Eppendorf) au fost utilizate pentru a minimiza aderența celulelor la pereții tubului. HEK 293T celule (1 milion), mouse-ul de hibridoame celule (1 milion de 5E4, KT13, și KT22 celule amestecat în raport de 1:1:1), ARH-77 celulele leucemice (ATCC CRL-1621, 1 milioane de euro), sau proaspăt izolate umane CD19+ celulele B din pre – și post-Td-booster imunizare probe (1.,5 milioane fiecare) au fost resuspendate în 1 mL PBS cu 50 µg/mL cicloheximidă și incubate timp de 10 minute pentru a bloca ribozomii cu ARNr mesager asociat (ARNm) la reticulul endoplasmatic dur. Celulele au fost granulat cu 300 g timp de 10 min la temperatura de 4 °C și omogenizată prin pipetarea 15× sus și în jos în 120 µL de înaltă densitate tampon de liză (25 mM HEPES-KOH cu pH 7.2, 110 mM, acetat de potasiu, 5 mM de magneziu, acetat de 1 mM EGTA, 25% zaharoză , 5% glicerină, 1 mM 1,4-dithiothreitol, 1× complet EDTA-gratuit amestec de inhibitori de protează , 0,1 mg/mL cycloheximide, 0.015% digitonin, și 400 U/mL RiboLock RNase inhibitor )., Liza celulară și organelle a fost finalizată prin incubare timp de 10 min pe gheață. Fiecare omogenat a fost împărțit în două alicote de 55 µL și transferat în două tuburi proaspete de LoBind proteic. Tuburile au fost centrifugate la 600 g timp de 3 minute la 4 °C până la nucleele de peleți și resturile celulare. Un total de 40 µL de supernatant de la fiecare tub, care conține membrana fracții și citosol, au fost transferate în Proteine proaspăt LoBind tuburi și zaharoză concentrare a fost diluat la 0.37–0,40 M (12-13% w/w) prin adăugarea de 40 µL nuclează-apă gratuită. Microzomii au fost apoi sedimentați prin centrifugare cu 20,800 g timp de 120 min la 4 °C., Citosol conțin supernatantele au fost aruncate și membrana pelete au fost omogenizată prin pipetarea 10× sus și în jos în 85 µL de soluție tampon de spălare (25 mM HEPES-KOH cu pH 7.2, 110 mM, acetat de potasiu, 2.5 mM, acetat de magneziu, 1 mM EGTA, 1 mM 1,4-dithiothreitol, 1× complet EDTA-gratuit amestec de inhibitori de protează, 0,1 mg/mL cycloheximide, 0.004% digitonin, și 400 U/ml RiboLock RNase inhibitor). Microzomii au fost sedimentați din nou prin centrifugare cu 20,800 g timp de 60 min la 4 °C., Supernatanții au fost aruncați și peletele microsomului au fost resuspendate în 20 µL de tampon de spălare și păstrate pe gheață până la utilizarea ulterioară.
de microscopie electronică de Transmisie
Exemplu alicote de 3,5 µL din suspensia va fi omogenizată, HEK 293T microzomi au fost aplicate proaspăt strălucire-evacuate Quantifoil grile (Quantifoil, Germania) acoperite cu o suplimentare de 2 nm carbon, suport de film și flash-înghețate în etanului lichid, folosind un Vitrobot piston (FEI). Probele au fost imaginate pe un microscop electronic de transmisie Tecnai Spirit (Fei) operat la 120 kV echipat cu o cameră 2 × 2 K Eagle CCD (Fei)., Micrografele au fost înregistrate în condiții crio-doze mici la o mărire nominală de 42.000× (dimensiunea pixelilor la scara obiectului: 5,2 Å / px) aplicând un defocus de − 2 până la − 4 µm. Colectarea datelor a fost efectuată manual sau complet automat folosind Leginon .am diluat 16 µL de microzomi resuspendați din hibridomele mixte 5e4, KT13 și KT22 în 184 µL RT-PCR master mix conținând 1× Verso 1-Step RT-PCR master mix (Thermo Scientific), 1× Verso enzyme mix (Thermo Scientific), 0.,5 µg/µL BSA, 100 µg/mL cycloheximide, și grunduri pentru transcriere inversă și HC și LC asamblare (0.8 µM fiecare dintre primeri TitA_MID1_IgM_rev și TitB_MID12_IgK_rev; 0.16 µM fiecare dintre primeri OE_MHV_fwd și OE_MKV_fwd). Grund secvențe sunt prezentate în fișier Suplimentar 1: Figura S1a. Rezultat 200 µL de soluție apoasă au fost folosite pentru a forma o apă-în-ulei de emulsie prin picurare (13 alicote de 15 µL în 30 de intervale) la 800 µL ulei de fază în funcție de Ge et al. (Ulei Mineral, Sigma M5904, cu 4,5% Span 80, Sigma S6760, Cu 0,4% Tween 80, Sigma P8074, și 0.,05% Triton X-100, Sigma T8787) în timpul agitării continue pe un agitator magnetic., Șase părți alicote de 100 µL fiecare dintre emulsia rezultată au fost transferate în tuburi PCR și supuse termociclu cu următoarele condiții: transcriere inversă de la 50 °C timp de 15 min, RTase de inactivare la 95 °C timp de 2 min, apoi patru cicluri de denaturare la 95 °C timp de 20 s, recoacere rampdown la 60 °C la 50 °C timp de 50 s și extensia la 72 °C timp de 1 min, apoi 16 cicluri de denaturare la 95 °C timp de 20 s, recoacere la 60 °C timp de 30 s și extensia la 72 °C timp de 1 min, urmată de o extindere finală pas la 72 °C timp de 5 min., În paralel, s-a efectuat un control RT-PCR deschis prin diluarea a 4 µL de microzomi resuspendați în amestecul principal RT-PCR de 46 µL și termociclarea reacției în paralel cu emulsia RT-PCR. PCR asamblare produse au fost extrase din emulsia folosind izobutanol (2-Metil-1-propanol, Sigma) și Zymo ADN-ul Curat & Concentrator-5 kit (Zymo Research) anterior publicate . ADN-ul rezultat și produsul PCR din controlul PCR deschis au fost încărcate pe un gel de agaroză TBE 1,2% și separate cu 90 V Timp de 60 min., Produsele de asamblare cu dimensiunea 800-950 bp au fost selectate din dimensiunea gelului de agaroză, iar produsele au fost recuperate folosind un kit de recuperare ADN Zymoclean Gel. Produsele de asamblare au fost eluate în 6 mM Tris-Cl pH 8 și depozitate la − 20 °C până la o analiză ulterioară.,
Nested PCR de amplificare de mouse-ul de hibridoame asamblare produse
După emulsie de asamblare reacție, asamblare produse au fost amplificată cu adaptor de primeri TitA_fwd, 5′ CGT ATC GCC TCC CTC GCG CCA TCA G 3′, și TitB_rev, 5′ CTA TGC GCC TTG CCA GCC CGC TCA G 3′, folosind Phusion de înaltă fidelitate ADN polimeraza kit (Finnzymes), cu următorul termociclu condiții: denaturare Inițială la 98 °C timp de 30 s, 15 cicluri de denaturare la 98 °C timp de 7 și recoacere/extensie la 72 °C timp de 30 s, urmată de o extindere finală pas la 72 °C timp de 5 min., Produsele PCR au fost purificate cu Zymo ADN Clean & Kit Concentrator-5. Asocierea de HC și LC în ansamblul produse au fost apoi analizate prin PCR folosind imbricate primeri specifici pentru trei tipuri diferite de HC și trei diferite LC (fișier Suplimentar 1: Figura S1e) folosind Phusion de înaltă fidelitate ADN polimeraza kit cu următoarele termociclu condiții: denaturare inițială la 98 °C timp de 30 s, apoi 24 de cicluri de denaturare la 98 °C timp de 7 și recoacere/extensie la 72 °C timp de 30 s, urmată de o extindere finală pas la 72 °C timp de 5 min., Produsele PCR imbricate au fost încărcate pe un gel de agaroză TBE 1.2% și separate cu 90 V Timp de 40 min. În timp Real nested PCR pentru cuantificarea contaminarea încrucișată fost efectuate în triplicat cu același imbricate grunduri folosind SYBRGreen master mix (applied Biosystems), la un pas unul qPCR cycler (applied Biosystems), cu următorul termociclu condiții: denaturare inițială la 95 °C timp de 10 min, urmată de 40 de cicluri de denaturare la 95 °C timp de 15 s, recoacere la temperatura de 56 °C timp de 30 s și extensia la 72 °C timp de 45 s., Abundențele inițiale ale produselor de asamblare amplificate au fost calculate utilizând metoda 2^(- deltaCt) și reprezentate grafic ca diagrame cu bare de eroare care arată abaterea standard de la medie.
imunizarea și izolarea celulelor CD19+ B din probele de sânge integral periferic
probele de sânge integral periferic uman utilizate în acest studiu au fost obținute de la in.vent Diagnostica GmbH ca subproduse din procedurile de diagnosticare de rutină. în.,aerisire Diagnostica GmbH a scris consimțământul informat de la donator pentru utilizarea subproduselor de cercetare și are o etică aprobare de la Freiburg Comisia de Etică Internațională (FEKI cod 011/1763) pentru distribuirea de eșantioane. Un proband sănătos a suferit o imunizare de rapel cu Toxoid tetanic(TT) / toxoid Dipteric (DT) (Td-pur®; 20 de unități internaționale TT și 2 UI DT; Novartis, Basel, Elveția)., K2-periferic recoltat pe EDTA sânge integral derivate din pre-imunizare (ziua 0) și șapte zile post-Td de rapel de imunizare au fost folosite pentru a izola CD19+ B celule folosind CD19 pluriBead Celula de Separare Kit (pluriSelect GmbH, Leipzig, Germania), în urma protocolul producătorului. Izolat CD19+ celule B pelete au fost spălate în 1 mL PBS rece și se centrifughează la 300 g timp de 10 min la temperatura de 4 °C. Celule pelete corespunzătoare la 1,5 milioane de celule B din ambele pre – și post-imunizare probele au fost păstrate la gheață până cycloheximide tratament și microsome pregătire.,
emulsie RT-PCR asamblare folosind microzomi umani de celule B
am adăugat 2 µL de microzomi diluați preparați din celulele arh-77 congelate (ca control intern de împerechere) la 26 µL de microzomi resuspendați din celulele B atât imunizare pre – cât și post-TD, astfel încât fracția finală a microzomilor ARH-77 este de 0,5% (v/v). Am diluat 16 µL din această suspensie de microzomi în 184 µL RT-PCR master mix conținând 1× DART 1-step RT-PCR master buffer mix( Roboklon), 2× dart master enzyme mix (Roboklon), 0.,5 µg/µL BSA, 100 µg/mL cicloheximidă și primeri pentru transcriere inversă (IgM, IgG și IgK) și asamblare cu lanț greu (VH) și ușor (VK). Secvențele de primeri și concentrațiile din amestecul RT-PCR master sunt enumerate în fișierul suplimentar 1: Tabelul s2., Rezultat 200 µL de soluție apoasă au fost folosite pentru a forma o apă-în-ulei de emulsie prin picurare (13 alicote de 15 µL în 30 de intervale) la 800 µL ulei de faza compus din 73% emulsie componenta 1, 7% emulsie componenta 2, și 20% emulsie componenta 3 a Micellula ADN emulsie și purification kit (Roboklon) timpul de agitare continuă pe un agitator magnetic., Șase părți alicote de 100 µL fiecare dintre emulsia rezultată au fost transferate în tuburi PCR și supuse termociclu cu următoarele condiții: transcriere Inversă la 55 °C timp de 30 min, initial denaturare la 95 °C timp de 3 min, apoi trei cicluri de denaturare la 95 °C timp de 20 s, recoacere la temperatura de 56 °C timp de 30 s și extensia la 72 °C timp de 2 min, apoi 20 de cicluri de denaturare la 95 °C timp de 20 s, recoacere la temperatura de 56 °C timp de 30 s și extensia la 72 °C timp de 4 min, urmată de o extindere finală pas la 72 °C timp de 5 min., PCR asamblare produse au fost extrase din emulsia folosind izobutanol (2-Metil-1-propanol, Sigma) și Zymo ADN-ul Curat & Concentrator-5 kit (Zymo Research) anterior publicate . ADN-urile rezultate au fost încărcate pe un gel 1% TBE-agaroză și separate cu 100 V Timp de 45 min. Produsele de asamblare de 700-800 bp au fost selectate din dimensiunea gelului de agaroză, recuperate folosind un kit de recuperare a ADN-ului Zymoclean Gel, eluate în 6 mM Tris-Cl pH 8 și depozitate la − 20 °C până la o analiză ulterioară.,
amplificarea PCR imbricată a produselor de asamblare a celulelor B umane
pentru amplificarea ulterioară specifică a produselor de asamblare HC-LC, s-a efectuat o amplificare PCR imbricată cu primeri imbricați specifici pentru regiunile constante IgM, IgG și IGK (fișierul suplimentar 1: Tabelul S2). Reacția PCR conținea primeri imbricați la concentrații de 0,4 µM, amestec dNTP de 200 µM, tampon de reacție 1× Q5 și polimerază ADN de înaltă fidelitate 0,02 U/µL Q5 (New England Biolabs) într-un volum de reacție de 50 µL cu 3 µL de ADN asamblat., Nested PCR amplificarea a fost realizată cu următoarele termociclu condiții: denaturare inițială la 98 °C timp de 3 min, apoi 34 cicluri de denaturare la 98 °C timp de 30 s și recoacere/extensie la 71 °C timp de 1 min, urmată de o extindere finală pas la 72 °C timp de 5 min. Probele au fost colectate după trei numere diferite ale ciclului PCR (28, 31 și 34 de cicluri). Produsele PCR amplificate au fost încărcate pe geluri 1% TBE-agaroză și separate cu 100 V Timp de 60 min., Produsele dorite de ~ 710 bp au fost extrase după cum este descris mai sus, succesiunea biblioteci au fost pregătite următoarele Illumina TruSeq mostră de ADN ghid de pregătire și 2 × 250 bază asociat-end citește erau ordonate, folosind Illumina MiSeq platforma.
analiza Bioinformatică a asociat cu anticorpi grele și ușoare a lanțului de repertorii
Demultiplexare de 2 × 250 bază asociat-end citește de la MiSeq platforma de secventiere a fost efectuat pe baza adaptor indici și secvențierea datele au fost obținute în fastq format., Citește doar cu minim Phred calitate scoruri de 10 peste 50% din toate nucleotide au fost reținute și scanate pentru IgM, IgG, și IgK regiune constantă de secvențe. Citește perechi lipsit de regiune constantă de secvențe sau care prezintă HC-HC sau LC-LC structura au fost filtrate și rămase citește-au transformat într-fastq format și utilizate ca date de intrare pentru analiza cu MiXCR (v1.2) pentru alinierea citește de referință V(D)J și C secvențe de gene de la IMGT baza de date , extragerea și gruparea de CDR-H3 nucleotide (fișier Suplimentar 1: Tabelul S1)., Secvențele HC-CDR3 care conțin frameshifts sau codoni stop și cu mai puțin de două citiri au fost filtrate. Am creat un fișier HC-LC pairing statistics pentru a demonstra utilizarea genei VH-VK asociate în repertoriile totale de gene HC-LC asociate. Hărțile de căldură au fost generate folosind R și afișate grafic folosind ggplot2. Apoi, inter-individuale TT specifice HC-CDR3 secvențe au fost identificate prin compararea HC-CDR3 secvențele de aminoacizi obținute la post-Td de rapel de imunizare probă a raportat anterior TT specifice HC-CDR3 secvențe .,
amplificarea prin PCR a full-length HC și LC secvențe
Am proiectat-o în două etape PCR bazate pe metoda de amplificare (fișier Suplimentar 1: Figura S5) să includă o restricție digestie site-uri potențial TT specifice HC și LC complete cu V(D)J secvență de gene. Acest lucru a permis clonarea eficientă a secvențelor HC și LC în vectorii de Expresie respectivi, precum și producerea de anticorpi recombinanți pentru studiile de legare in vitro., Pe scurt, am selectat 14 asociat HC-LC CDR3 clonotypes obținute de la IgG secvențiere post-Td de rapel de imunizare în funcție de frecvența lor, asocierea precizie, și ori diferența între top1 LC-CDR3 și top2 LC-CDR3 asociat la dat HC-CDR3 secvență. Am extras ARN total din celulele B congelate izolate din imunizarea rapelului post-Td folosind purificarea reactivului TRIzol (Ambion) conform instrucțiunilor producătorului. În prima etapă, RT-PCR de amplificare pentru fiecare selectate HC – și LC-CDR3 clonotype a fost efectuată separat folosind dART 1-RT-PCR kit (Roboklon)., RT-PCR master mix (25 µL) conținute HC și LC V gene specifice înainte primeri cu BssHII site de restricție consolele împreună cu individuale CDR3 specifice inversă primeri cu 18 nucleotide de FR4 regiune la 0,4 µM concentrații (fișier Suplimentar 1: Tabelul S3 și Figura S5), 1× dART 1-RT-PCR master tampon se amestecă, 1× dART master enzimă se amestecă, și 4,5 ng ARN-ul total., Termociclu condiții au fost după cum urmează: transcriere inversă la 55 °C timp de 30 min, initial denaturare la 95 °C timp de 3 min, apoi 23 de cicluri de denaturare la 95 °C timp de 20 s, recoacere la temperatura de 56 °C timp de 30 s și extensia la 72 °C timp de 90 s, urmată de o extindere finală pas la 72 °C timp de 5 min. RT-PCR au fost purificați prin care Agencourt AMPure XP – PCR purification kit (Beckman Coulter) urmând instrucțiunile producătorului și eluat în 6 mM Tris-Cl pH 8.0., În cea de-a doua etapă, produsele RT-PCR purificate au fost utilizate ca șablon pentru amplificarea PCR utilizând polimeraza ADN de înaltă fidelitate Q5 (New England Biolabs). Imbricate PCR master mix (50 µL) conținute înainte grunduri codare o BssHII site de restricție și de trei nucleotide de HC sau LC germline secvență de gene împreună cu reverse grunduri conțin completă FR4 regiune și NheI/Hin restricție consolele la 0,4-µM concentrații (fișier Suplimentar 1: Tabelul S3 și Figura S5), 4 µL de ADN purificat, 200 µM dNTP mix, 1× Q5 reacție tampon, și 0.,02 U / µL Q5 polimerază ADN de înaltă fidelitate (New England Biolabs). Termociclu condiții au fost după cum urmează: denaturare inițială la 98 °C timp de 3 min, apoi 16 cicluri de denaturare la 98 °C timp de 30 s, recoacere la 69 °C pentru 30 s și extensia la 72 °C timp de 1 min, urmată de o extindere finală pas la 72 °C timp de 5 min. Produșii PCR au fost separate pe o TBE-gel de agaroză, full-lungime HC și LC ampliconilor cu restricție de digestie site-uri au fost extrase din gel folosind Zymoclean Gel ADN-ul Kit de Recuperare (Zymo Research) și produsele au fost depozitate la − 20 °C până la utilizare ulterioară.,
Clonare și exprimare recombinant anticorpi monoclonali
Restricție digestie de lungime completă HC și LC inserții și de exprimare a vectorilor (pCMV-CD30-4IE3_HC și pCMV-CD30-4IE3_LC) a fost realizată cu enzime de restricție BssHII, NheI și Hin (New England Biolabs). Produsele rezultate au fost încărcate pe geluri TBE-agaroză 2% și benzi de ~ 5.9 kb pentru coloana vertebrală a vectorului HC, 5.3 kb pentru coloana vertebrală a vectorului LC, ~ 370 bp pentru inserții HC și ~ 340 bp pentru inserții LC au fost selectate pe geluri de agaroză și purificate așa cum este descris mai sus., Ligations de insertii si vectori pentru a amplificat HC și LC clonotypes au fost efectuate folosind instant lipicios-end ADN-ul ligase (New England Biolabs) și transformat într-o lovitură competente din punct de vedere chimic E. coli TOP10 celule (IBA) în urma instrucțiunile producătorului. Plasmida Adn au fost izolate din transformat colonii (8-16 colonii), folosind QIAprep spin miniprep kit (Qiagen); asemănări la un consens secvențe au fost confirmate folosind capilar secvențiere Sanger., Secvențele de ADN plasmidic HC și LC care s-au potrivit cel mai aproape de secvențele de consens au fost co-transfectate în celule renale embrionare umane HEK 293 t (ATCC, CRL-11268) celule. Celulele T HEK 293 au fost cultivate folosind glucoză bogată (4,5 g/L D-glucoză) mediul Eagle modificat al lui Dulbecco (Gibco BRL) suplimentat cu ser fetal bovin IgG ultra-scăzut inactivat termic (Thermo Fisher Scientific), penicilină 100 U/mL și streptomicină 100 µg/mL. Purificat plasmidă Adn asociat pentru HC și LC clonotypes au fost co-transfectate în 85-95% confluente HEK 293 celulele T folosind PEI (polyethyleneamine, Polysciences)., Supernatantele de cultură au fost colectate la patru zile după transfecție, iar clonotipurile specifice antigenului TT au fost identificate prin ELISA indirectă.
de imunoabsorbție Enzimatică (ELISA)
Am efectuat indirecte teste ELISA pentru identificarea mAbs derivate din imunizate proband legare la TT antigen folosind celule transfectate cultura supernatantele. Plăcile solide nunc-Immuno MicroWell 96-well (Thermo Fisher Scientific) au fost acoperite cu 100 µL de antigen TT 10 µg/mL (Statens Serum Institute, Copenhaga, Danemarca) în tampon carbonat 50 mM pH 9.,6, incubat peste noapte la 4 °c, spălat de trei ori cu PBS și blocat cu 2% lapte uscat fără grăsimi (Bio-Rad) în PBS timp de 150 min la temperatura camerei. După blocarea, 120 µL de 1:2 în serie diluat transfectate în supernatantele PTM (PBS, cu 0,1% Tween-20, 2% fără grăsimi din lapte) au fost adăugate la wells, 350 ng al mouse-ului anti-TT mAb (GeneTex) a fost aplicat un bine ca un control pozitiv, și plăcile au fost incubate timp de 1 h la temperatura camerei. Plăcile au fost spălate de trei ori cu PBS-T (0.,1% Tween-20) și 50 µL de 1:2000 diluție de capră anti-uman kappa LC-HRP anticorpul secundar (Thermo Fisher Scientific) au fost adăugate la wells, 50 µL de 1:2000 diluție de capra anti-IgG de șoarece HC-HRP anticorpul secundar (Sigma #A0168) au fost adăugate la control pozitiv de bine, plăcile au fost incubate timp de 2 min la temperatura camerei și se spală de trei ori cu PBS-T. Pentru dezvoltare de culoare, am adaugat 50 µL de un pas Ultra TMB-ELISA substrat (Thermo Fisher Scientific) pe ei, se incubează plăcile timp de 5 min la temperatura camerei, și a oprit Ag:Ab obligatoriu reacția prin adăugarea a 50 µL 2 M H2SO4., Absorbția a fost măsurată la 450 nm utilizând sistemul de detectare multiplă GloMax (Promega). Teste ELISA pentru toate clonotypes au fost efectuate în triplicat, valorile s-au normalizat pentru a elimina semnale de fond, iar erorile au fost reprezentate ca abateri standard de la medie.
Analiza de himerică amplicon formarea în timpul nested PCR
Patru definite HC-LC ampliconi au fost generate de amplificarea HC și LC din respectiva pCMV plasmide (a se vedea mai sus) și, folosind un PCR asamblare reacție pentru a genera patru distincte HC-LC ansambluri., HC și LC plasmidă Adn au fost utilizate ca șabloane pentru amplificarea PCR a Top1, Top2, Top3, și Top4 clonală lanț perechi folosind primeri specifici pentru fiecare VH și VK familii genetice și IgG și IgK regiuni constante (fișier Suplimentar 1: Tabelul S2 și Figura S6a). ADN plasmidic purificat (10 ng) a fost adăugat la fiecare reacție PCR de 25 µL conținând 0,4 µM din fiecare primer, amestec dNTP de 200 µM, tampon de reacție 1× Q5 și polimerază ADN de înaltă fidelitate 0,2 U/µL Q5., Ciclism termică a fost realizată cu denaturare inițială la 98 °C timp de 3 min, urmată de 25 de cicluri de denaturare la 98 °C timp de 30 s, recoacere/extensie la 71 °C timp de 1 min (pentru HC ADN-ul plasmidic) sau recoacere la 64 °C timp de 1 min și extensia la 72 °C timp de 1 min (pentru LC ADN-ul plasmidic), urmat de un final extensia pas la 72 °C timp de 5 min. Produsele PCR au fost încărcate pe geluri separate de 1% TBE-agaroză și separate cu 100 V Timp de 60 min. Produsele ADN dorite de ~ 400 bp (pentru HC) și ~ 350 bp (pentru LC) au fost selectate și extrase din gel așa cum este descris mai sus., Produsele purificate HC și LC PCR au fost utilizate ca șabloane pentru asamblarea HC și LC prin extensie suprapusă PCR (fișier suplimentar 1: Figura S6b). Pe scurt, 5 ng de fiecare HC și corespunzătoare asociat LC ADN au fost adăugate în fiecare 50 µL reacția PCR conțin 1× dART 1-RT-PCR master tampon (Roboklon), 2× dART master enzimă (Roboklon), și 0,4 µM din fiecare IgG și IgK regiune constantă (grund Suplimentare fișier 1: Tabelul S2)., Ciclism termică a fost realizată cu RT inactivarea la 95 °C timp de 3 min, urmată de trei cicluri de denaturare la 95 °C timp de 20 s, recoacere la temperatura de 56 °C timp de 30 s și extensia la 72 °C timp de 2 min, urmată de 25 de cicluri de denaturare la 95 °C timp de 20 s, recoacere la temperatura de 56 °C timp de 30 s și extensia la 72 °C timp de 4 min, urmată de o extindere finală pas la 72 °C timp de 5 min. Produsele de asamblare au fost încărcate pe geluri 1% TBE-agaroză și separate cu 100 V Timp de 45 min. Produsele de asamblare de ~ 750 bp au fost selectate în mărime și extrase din gelul de agaroză așa cum este descris mai sus., Individual asamblate HC-LC clonală perechi au fost reunite și folosit ca șablon pentru imbricate amplificare PCR cu primeri specifici pentru IgG și IgK regiuni constante (fișier Suplimentar 1: Tabelul S2, Figura S6c). Reacția PCR imbricată și condițiile de ciclare termică au fost aceleași cu cele descrise în secțiunea” amplificarea PCR imbricată a produselor de asamblare a celulelor B umane”, cu excepția faptului că amplificarea PCR a fost efectuată timp de 25 de cicluri. Produsele PCR au fost încărcate pe geluri 1% TBE-agaroză, separate cu 100 V Timp de 60 min și produsele dorite de ~ 720 bp au fost extrase așa cum este descris mai sus., Secvențierea biblioteci din soluții individuale și de amestecat ansambluri după nested PCR au fost pregătite următoarele Illumina TruSeq mostră de ADN ghid de pregătire și 2 × 250 bază asociat-end citește au fost generate folosind Illumina MiSeq platforma.