16S rRNA-Gensequenzierung wird üblicherweise zur Identifizierung, Klassifizierung und Quantifizierung von Mikroben in komplexen biologischen Gemischen wie Umweltproben (ex Meerwasser) und Darmproben (ex menschliches Darmmikrobiom) verwendet., Das 16S-rRNA-Gen ist ein hochkonservierter Bestandteil der Transkriptionsmaschinerie aller DNA-basierten Lebensformen und eignet sich daher als Zielgen für die Sequenzierung von DNA in Proben mit bis zu Tausenden verschiedener Spezies. Universelle PCR-Primer können so konzipiert werden, dass sie auf die konservierten Regionen von 16S abzielen und es ermöglichen, das Gen aus einer einzigen Probe in einer Vielzahl verschiedener Mikroorganismen zu amplifizieren. Praktischerweise besteht das 16S-rRNA-Gen sowohl aus konservierten als auch aus variablen Regionen (Abb. 1)., Während die konservierte Region eine universelle Amplifikation ermöglicht, ermöglicht die Sequenzierung der variablen Regionen eine Diskriminierung zwischen spezifischen verschiedenen Mikroorganismen wie Bakterien, Archaeen und mikrobiellen Eukarya. Die Identifizierung von Viren erfordert eine metagenomische Sequenzierung (die direkte Sequenzierung der gesamten DNA, die aus einer mikrobiellen Gemeinschaft extrahiert wird), da das phylogenetische Markergen 16S fehlt.
Fig 1 – Ungefähr 1,5 kb 16S rRNA-Gen von E. coli, das die neun variablen Regionen zeigt, die es zu einem idealen Ziel als phylogenetisches Markergen machen.,
Ursprünglich erforderten Untersuchungen von Umweltproben den Anbau und die Isolierung von Arten zur Identifizierung, ein mühsamer und zeitaufwändiger Prozess. Die Kopplung der 16S-rRNA-PCR mit der Sequenzierung der nächsten Generation hat jedoch die Untersuchung vieler Proben zu geringen Kosten ermöglicht. Frühe 16S rRNA-Sequenzierungsstudien haben bereits viele Sequenzen gefunden, die keiner bekannten kultivierten Spezies angehören, was darauf hindeutet, dass es zahlreiche nicht isolierte Organismen gibt und dass kultivierungsbasierte Methoden nur einen kleinen Prozentsatz der bakteriellen und archaealen Spezies in einer Probe finden., Darüber hinaus können wir mit dem Multiplexen vieler Proben und der hohen Deckungstiefe der heutigen Next-Gen-Plattformen jetzt Proben aus umfassenden Zeitreihen analysieren, um die Dynamik der mikrobiellen Gemeinschaft an vielen Standorten zu quantifizieren oder detaillierte 3D-Karten von mikrobiellen Gemeinschaften zu erstellen sowie zu untersuchen, ob Veränderungen seltener oder häufiger Arten mit Gesundheit und Krankheit verbunden sind.
Fig 2 – Clustering von 5′ und 3′ liest aus verschiedenen Umweltproben zeigen, dass Proben aus einer gegebenen Umgebung Typ Cluster zusammen gut.,
Lesevorgänge aus der Next-Gen-Sequenzierung können zur Identifizierung und Klassifizierung gegen kuratierte Datenbanken wie das Ribosomal Database Project (RDP), GreenGenes und SILVA gesprengt werden. Verwandte Sequenzen werden „gruppiert“ und die Anzahl der Vertreter jedes Clusters gezählt. Cluster ähnlicher Sequenzen werden als „Operational taxonomic Units“ (OTUs) bezeichnet. OTU-Zählungen werden in einer Tabelle mit relativen Häufigkeiten für jeden Organismus in jeder Probe zusammengefasst., Bis heute wurden mehrere Analysepipelines für die Analyse von 16S-rRNA-Gensequenzdaten entwickelt, und zwei häufig verwendete Pipelines sind QIIME und Mothur. QIIME entnimmt Benutzern ihre rohe Sequenzierungsausgabe durch erste Analysen wie OTU-Kommissionierung, taxonomische Zuordnung und Konstruktion phylogenetischer Bäume aus repräsentativen OTUS-Sequenzen sowie durch nachgelagerte statistische Analysen, Visualisierung und Erstellung von Grafiken in Publikationsqualität.,
LC Sciences bietet einen umfassenden 16SrRNA-Gensequenzierungsdienst zur Identifizierung und Klassifizierung von Arten in mikrobiellen Proben. Wir verwenden eine Dual Zone (Amplified Zones V3 + V4) 16S rDNA Fragment Amplification Strategie, Sequenz auf der branchenführenden Illumina MiSeq Plattform und bieten umfangreiche Datenanalyse einschließlich: Sequenzierung von Datenausgabestatistiken, Sequenzclustering in operative taxonomische Einheiten (OTU), Diversitätsanalyse, Speziesklassifikation und Abundanzanalyse.,
Kürzlich verwendete einer der Kunden von LC Sciences die 16S-rRNA-Gensequenzierung, um die mikrobielle Ausbreitung der Luft in verschmutzten Gebieten zu untersuchen, in denen widrige Wetterbedingungen eine doppelte Verschmutzung von Staub und Smog verursachen.