co je PCR? – Průvodce pro začátečníky

PCR je technika moderních laboratoří molekulární biologie. Pokud potřebujete kopírovat, sekvenci nebo kvantifikovat DNA, musíte znát PCR. Ve zkratce, PCR (polymerázová řetězová reakce) je biochemická technika, která používá thermocycling a enzymy rychle a spolehlivě kopírování DNA, a to bylo vynalezeno v záblesku inspirace vědec jízdě na Dálnici 128 ze San Francisca do Mendocina.,

Tento článek poskytuje stručný, základní přehled PCR, s několika tipy, které vám pomohou vyhnout se nejčastějším nástrahám. Pokud jste nový, nebo relativně nový PCR, pak je to pro vás. (A i když máte zkušenosti s PCR je dobře stojí za to číst obnovit, a možná chytit tip nebo dva!).

základní PCR složky:

polymeráza

polymerázy jsou enzymy, které za správných podmínek mohou sestavit nové řetězce DNA ze šablony DNA a nukleotidů. Původní PCR reakce byla těžkopádná, protože vysoké teploty potřebné k denaturaci DNA by polymerázy zabily., To znamenalo, že po každém topném cyklu bylo nutné k reakci ručně přidat nové polymerázy-drahé úsilí. V moderním PCR to však není problém, protože polymerázy používané v moderním PCR obvykle pocházejí z jednoho ze dvou termofilních zdrojů bakterií, Thermus aquaticus nebo Pyrococcus furiosus. Tyto polymerázy, respektive Taq (vyslovováno „tack“) a Pfu (vyslovováno „P-F-u“) snadno odolávají vysokým teplotám spojeným s PCR reakcí., Komerční Taq a Pfu polymerázy jsou navrženy pro rychlost, věrnost, procesivitu (schopnost dokončit dlouhé čtení) a jejich schopnost číst šablony bohaté na GC. Firmy neustále přicházejí s novými polymerázami. Proto se Nespokojte s „co je ve vašem mrazáku“, ale nakupujte nejlepší komerční polymerázu pro vaše potřeby PCR. Promluvte si také s místním obchodním zástupcem, protože mohou často rozdávat volné vzorky polymerázy, takže se můžete rozhodnout, co je pro vás nejlepší.

template DNA

toto je DNA, do které navrhujete své primery., Je to DNA, kterou bude vaše polymeráza číst a kopírovat. Vaše DNA šablony může být genomická, plasmid nebo cDNA, ale bez ohledu na kvalitu vašeho zdroje. Čím neporušenější a čistší je vaše DNA šablony, tím snazší je získat dobré výsledky PCR. Mějte také na paměti, že ideální množství DNA bude záviset na vašem zdroji, obvykle 1 pg – 1 ng PLAZMIDOVÉ DNA nebo 1 ng – 1 µg genomické DNA na PCR reakci.

primery

primery jsou krátké fragmenty syntetizované DNA, které se vážou na vaši DNA šablony. Budete muset navrhnout Jeden“ přední „základní nátěr a jeden“ reverzní “ základní nátěr., Váš přední primer označuje začátek vašeho PCR. Sekvence tohoto primeru je stejná jako sekvence DNA šablony 5-3. Váš reverzní primer označuje konec vašeho PCR. Tato sekvence primeru je zpětným doplňkem vaší DNA šablony. Obecně platí, že primery jsou 18-22 párů bází dlouhé. Důležitější než jejich délka je však teplota tání vašich primerů. Teplota tání vašich primerů by měla být 54-60°C a co nejpodobnější., Existuje spousta online kalkulaček, které mohou vypočítat teploty žíhání primeru, a většina společností, které syntetizují primery, dodává takové kalkulačky.

nukleotidy

jako monomery DNA jsou nukleotidy nezbytné pro vytváření kopií DNA. Pro většinu PCR DNA budete používat deoxynukleosidové trifosfáty (dNTPs). Můžete si je koupit samostatně nebo jako mix dgtp, dCTP, dATP a dTTP. Ať už si koupíte ačkoli, mějte na paměti, že nukleotidy jsou velmi citlivé na zmrazení/rozmrazování cyklů. Proto je nejlepší vždy vytvářet malé alikvoty vašich dNTPs., Také se ujistěte, že je správně ukládáte-nepoužívejte mrazničku bez mrazu, která prochází automatickými cykly odmrazování.

Buffer

většina komerčních polymeráz je dodávána s jejich ideálním pufrem. Tyto pufry nejen dodávají správné pH, ale vždy mají přísady jako hořčík, draslík nebo DMSO, které pomáhají optimalizovat denaturaci DNA, renaturing a polymerázovou aktivitu. O těchto přísadách bude v nadcházejícím článku více.

Thermocycling:

to je místo, kde magie se děje., Všechny výše uvedené složky se přidávají do zkumavky PCR a trubice je termocycled. Za účelem dosažení termocycling při PCR byl poprvé vynalezen jednotlivé PCR trubky byly ručně přesunuty mezi vyhřívané vodní lázně. (A Vy si myslíte, že vaše práce na lavičce je únavná!) Nyní, díky vynálezu „Mr. Cycles“, prvního termocyclingového stroje, je regulace teploty nyní prováděna automaticky termocyklery. Následuje typický profil termocycleru PCR:

inicializace

v tomto kroku se reakce zahřívá na 94-96°C po dobu 30 sekund až několika minut., Tento krok se obvykle provádí pouze jednou na samém začátku reakce PCR. Tento krok je důležitý pro aktivaci hot-start polymeráz, pokud používáte takovou polymerázu, a denaturovat šablonu DNA. Mějte na paměti, že pokud je obsah šablony GC vysoký, možná budete muset provést extra dlouhý Inicializační krok.

denaturace (opakovaná 15-40krát)

v tomto kroku se reakce zahřeje na 94-98°C po dobu 15-30 sekund. Tento krok denaturuje vaši DNA a primery, což jim umožní žíhat si navzájem v dalším kroku.,

žíhání (opakované 15-40 krát)

v tomto kroku se teplota reakce rychle sníží na 50-64°C po dobu 20-40 sekund. Teplota v tomto kroku musí být dostatečně nízká, aby vaše denaturované primery mohly tvořit páry základny Watson-Crick s vaší DNA šablony. Ale dostatečně vysoká, že se mohou tvořit pouze nejstabilnější (dokonale spárované) dvouvláknové struktury DNA. Obvykle je tato dokonalá teplota žíhání o několik stupňů nižší než teplota tání vašeho páru primerů. Také během tohoto kroku se vaše polymeráza váže na váš komplex DNA primeru/šablony., Ačkoli vaše polymeráza nezačne číst, dokud se teplota nezvýší v dalším kroku.

Prodloužení nebo Rozšíření (opakované 15-40 krát)

V tomto kroku, vaše reakce se rychle zahřívá na 72 až 80°C. To je, když vaše polymeráza začne čtení (ve směru 5-3) a kopírování templátové DNA (v 3-5direction). Vyšší teplota během tohoto kroku snižuje nespecifické interakce primeru / šablony DNA, čímž se zvyšuje specificita vaší reakce., Přesná teplota však bude určena preferencí vaší polymerázy, takže si přečtěte obal. Délka tohoto kroku závisí na tom, jak dlouho bude vaše kopie DNA. DNA polymeráza může obvykle kopírovat 1 000 párů bází za minutu. Proto musíte povolit alespoň 1 minutu prodloužení na 1 000 základen. Na konci této inkubace budou vytvořeny nové dvouvláknové kusy DNA, skládající se jak ze šablony, tak z nové DNA.

krok 2-4 se pak opakuje 15-40krát

je pravda, že čím více cyklů naprogramujete, tím více kopií DNA vytvoříte., Existuje však horní hranice. V určitém okamžiku se volné nukleotidy stávají omezujícími a předčasně zkrácené kopie DNA se mohou stát problémem. Takže nebuďte chamtiví s vaší cyklistikou. Méně, ale dobrý čistý produkt PCR je vhodnější než spousta špinavého produktu.

konečné prodloužení

jedná se o volitelný, ale často doporučený krok. V tomto kroku se reakce udržuje při teplotě 70-74°C po dobu několika minut. (Obvykle budete používat stejnou teplotu, jakou jste použili v kroku prodloužení nebo prodloužení.) Tento krok umožňuje polymerázy dočíst, co strand jsou v současné době na., Tento volitelný krok může pomoci snížit počet zkrácených kopií ve vašem konečném produktu.

Final hold

vaše reakce je nyní dokončena. Protože celý proces může trvat několik hodin, PCR reakce jsou často udělat přes noc, nebo když jste jinak vykročil pryč, je doporučeno, že budete vašem programu termocykleru držet PCR produktu při teplotě 4°C do doby, než se vrátíte. V té době můžete svůj produkt analyzovat nebo používat, nebo jej přenést do vhodnějšího dlouhodobého skladování, jako je vaše chladnička.

hodně štěstí a šťastný PCR-ing!