Detekci Pneumocystis jiroveci v Dýchacích Vzorků pomocí Čtyř Metod Barvení

Pneumocystis jiroveci, dříve známá jako Pneumocystis carinii, zůstává významnou příčinou pneumonie u imunokompromitovaných pacientů, i když infekce s touto agent snížily po rozšířené používání vysoce aktivní antiretrovirové terapie (HAART) na virus lidské imunodeficience (HIV), (9, 12). Pacienti, kteří jsou imunokompromitováni z jiných důvodů než infekce HIV, jsou také ohroženi pneumonií způsobenou P., jiroveci, včetně pacientů s hematologických malignit a ti, kteří obdrželi imunosupresivum pro léčbu autoimunitních onemocnění (2, 11, 12).

i když řada amplifikační testy nukleové kyseliny, včetně real-time PCR testy byly vyvinuty pro detekci P. jiroveci, tyto testy nejsou běžné ve většině klinických mikrobiologických laboratoří a nejsou komerčně dostupné (3, 5). Proto je hlavní laboratorní metoda pro detekci P., jiroveci, organismus, který nelze kultivovat standardními metodami, je přímé vizuální vyšetření klinického vzorku po nějakém typu barvicí metody (12). K detekci Pneumocystis v klinických vzorcích byly použity různé histochemické skvrny. Tyto histochemické skvrny zahrnují Diff-Quik, Grocott – Gomori methenamin silver (GMS) a Calcofluor bílé skvrny. Diff-Quik stain je modifikace Wright stain (3). GMS stain je stříbrná srážecí skvrna běžně používaná k vizualizaci hub v histologických sekcích (10)., Calcofluor white skvrna je fluorescenční barvivo, aktivní složka, která je cellufluor, které nespecificky váže na beta-spojené polysacharidy, jako jsou chitin a celulóza, a je používán pro přímé vizualizace hub v klinické vzorky (4). Immunofluorescent skvrny, které používají protilátky proti P. jiroveci, jsou také k dispozici pro přímé detekce tohoto organismu v klinických vzorků (3, 5). Tyto skvrny jsou podobné přímé a nepřímé immunofluorescent skvrny používá pro detekci virů v klinických vzorcích., Každá skvrna má své zastánce; srovnávací údaje v haartově éře jsou omezené.

Proto jsme provedli multi-institucionální hodnocení ze čtyř běžně používaných metod barvení pro přímou detekci P. jiroveci v klinických respiračních vzorků. Snímky ze studovaných respiračních vzorků, z nichž většina byly bronchoalveolární výplachové vzorky, byly připraveny za použití cytocentrifugace. Opakování stěrů z 313 respirační vzorky předložené k P. jiroveci vyšetření byly vyšetřeny na přítomnost P. jiroveci s Calcofluor white (Fungifluor; Polysciences, Inc.,, Warington, Pa.), GMS, Diff-Quik (Baxter, McGraw Park, Ill.) a Merifluor Pneumocystis (Meridian Bioscience, Inc., Cincinnati, Ohio). Diapozitivy byly obarveny skvrnami Merifluor Pneumocystis a Diff-Quik podle pokynů výrobce. Pro Calcofluor white barvení, 1 kapku Fungifluor bylo přidáno do každé sklíčko, krycí sklíčko byla nanesena tak, že činidla se vztahuje na celý vzorek obsahující oblasti, a posuňte bylo dovoleno sedět po dobu alespoň 10 min v tmavé vlhké komoře při pokojové teplotě před výklad s fluorescenční mikroskop., Pro GMS barvení, snímky byly v mikrovlnce po dobu 40 s, v 10% roztoku kyseliny chromové, promyje vodou, a pak vymazána s 1% roztokem disiřičitanu na 30 sekund. Po sklíčka se promyjí destilovanou vodou, byly umístěny v nádobě Coplin obsahující 50.0 ml pracovního roztoku methenamin a v mikrovlnce na další 65 s., Snímky byly znovu opláchnout destilovanou vodou, smísí s 1% chloridu zlatitého pro 2 až 5 s, opláchnuty destilovanou vodou, které jsou vystaveny 5% thiosíranu sodného po dobu 1 min, s kontrastním světle zelené pracovní roztok, vymazány v xylenu, které s krycí sklíčka, a vyšetřen rutinní světelná mikroskopie.

Každý z laboratoří ze čtyř zúčastněných institucí, provádí jeden z různých skvrn a vykreslení jejich interpretace založené na barvení metodou., Jednotlivci v každé instituci měli zkušenosti s metodou barvení a interpretací skvrny. Vzorky dostaly jedinečné identifikační kódy a každá skvrna byla vyšetřena nezávisle, bez znalosti výsledku získaného jinou metodou barvení na stejném vzorku., Množství vzorku bylo jen zřídka dostatečné pro všechny čtyři diapozitivy; 308 snímky byly k dispozici pro barvení s Calcofluor white, 310 snímků byly k dispozici pro barvení s Merifluor Pneumocystis, 307 snímky byly k dispozici pro barvení Diff-Quik, a 310 snímků byly k dispozici pro barvení s GMS. V žádném z případů, kdy snímek nebyl k dispozici z důvodu nedostatečného množství vzorku, závisí kategorizace tohoto vzorku jako skutečného pozitivního nebo skutečného negativního (viz níže) na výsledku chybějícího snímku.,

hodnoty citlivosti, specificity a pozitivních a negativních prediktivních hodnot byly vypočteny standardními metodami (Tabulka 1). Proporce pravda-pozitivní a falešně pozitivní výsledky pro párové testy byly ve srovnání s chi-square test pomocí EpiCalc 2000 statistického softwaru (www.brixtonhealth.com/epicalc.html).

i když více platí-pozitivní vzorky byly detekovány Merifluor Pneumocystis skvrnu, tento počet se výrazně neliší od těch odstranění podle Calcofluor white (P = 0.260) a GMS (P = 0.343) skvrny., Podobně počet skutečných pozitiv zjištěných gms a Calcofluor bílé skvrny nebyly výrazně odlišné (P = 0,838) od sebe navzájem. Počet skutečných pozitiv zjištěných skvrnou Diff-Quik však byl výrazně menší než počet zjištěných merifluor Pneumocystis (P = 0, 002), GMS (P = 0, 027) a calcofluor White (P = 0, 042) skvrny. Počet falešných pozitiv se významně nelišil mezi skvrnami Calcofluor white, GMS a Diff-Quik (každé srovnání mělo hodnotu P > 0.05)., Počet falešných poplachů hlášených po barvení s Merifluor Pneumocystis skvrny, nicméně, byl výrazně větší, než ty, které byly hlášeny po barvení s GMS (P = 0,004), Calcofluor white (P = 0,001), nebo Diff-Quik (P = 0,001).

V některých případech, indukovaného sputa vzorku může být první exemplář obdržel pro posouzení přítomnost Pneumocystis v diagnostické vyšetření pacienta s pneumonií podezření, že je způsoben tento organismu (6)., Pokud indukovaného sputa vzorku nedokáže výnos etiologickým agens pneumonie, pak vzorky z bronchoalveolární laváž, což je výrazně nákladnější, a nese malé riziko pro pacienta, může být potřebné k získání diagnostického materiálu., Kvůli rozdílům v léčbě pneumonie způsobené Pneumocystis proti zápalu plic způsobené jinými mikroorganismy a možné potřebě bronchoskopie, která vznikají další náklady a rizika pro pacienta, v případě, že diagnóza není stanovena, je důležité, že nejlepší možný způsob barvení být použity pro detekci tohoto organismu.,

kromě toho, že je důležité citlivé a specifické barvící metody v éře HAART je zvláště důležité, protože nižší výskyt pneumonie způsobené Pneumocystis nepříznivě ovlivňuje pozitivní prediktivní hodnota kteréhokoli testu, který má specificitu méně než 100% (9). I když výskyt pneumonie způsobené Pneumocystis se liší v HAART éry, než v pre-HAART éry, výběr optimální způsob barvení pro detekci Pneumocystis je také důležité pro pacienty s jinými immunocompromising podmínky kteří jsou v ohrožení pro infekce., Ve skutečnosti, volba optimální způsob barvení může být více důležité pro detekci Pneumocystis v non-infikovaných virem HIV, pacientů s oslabenou imunitou, protože bylo prokázáno, že respirační vzorky z těchto pacientů mají nižší zátěž organismy, než ty z infikovaných HIV, pacientů s oslabenou imunitou (6).

podle našich zkušeností nebyla skvrna Diff-Quik účinným prostředkem screeningu na přítomnost P. jiroveci (tj. Výrazně více exemplářů, které obsahovaly P., jirovci chyběli metodou Diff-Quik než u Calcofluor white, Merifluor Pneumocystis a GMS. Raab et al. popište také nízkou citlivost (68%) a nízkou specificitu (88%), když byla skvrna Diff-Quik použita pro detekci Pneumocystis a jiných hub ve vzorcích bronchoalveolárního výplachu (10). Tato zjištění jsou však na rozdíl od zjištění jiných skupin, které uvádějí, že metoda Diff-Quik byla srovnatelná s metodou barvení GMS pro detekci Pneumocystis (7, 8)., Jedna skupina uvedla, že Diff-Quik metoda byla citlivější než Calcofluor white, přímé immunofluorescent barvení, a dokonce i PCR, ale tyto výsledky nebyly potvrzeny (1).

naopak, skvrna Merifluor Pneumocystis byla nejcitlivější metodou barvení a může se ukázat jako užitečná jako obrazovka k vyloučení přítomnosti Pneumocystis, ale byla to nejméně specifická metoda v této studii. Počet falešně pozitivních výsledků s skvrnou Merifluor Pneumocystis byl však výrazně vyšší než počet hlášených pro každou z ostatních skvrn., Na Merifluor Pneumocystis skvrna měla pozitivní prediktivní hodnota jen 81.9%, ve srovnání s ostatní tři metody, z nichž všechny měly pozitivní prediktivní hodnoty větší než 96%. Ng et al. popsali také zjevné falešně pozitivní výsledky s touto metodou barvení (8). Proto jsme naznačují, že pokud Merifluor Pneumocystis se používá jako základní barvící metody v klinické mikrobiologie laboratoře, pak potvrzení, druhá metoda by měla být provedena pro zvýšení specificity a pozitivní prediktivní hodnota konečný výsledek zkoušky.,

citlivost obou Calcofluor white a GMS skvrny byly uprostřed mezi těmito Diff-Quik a Merifluor Pneumocystis skvrny, ale oni byli velmi konkrétní a pozitivní prediktivní hodnoty nad 96% a negativní prediktivní hodnoty nad 93%. Fraire et al. také popsal Calcofluor white a GMS skvrny jako srovnatelné pro detekci Pneumocystis, s 92.6% konkordance (4). Baughman et al., (1a) také popisují citlivost nepřímé immunofluorescent protilátek skvrna, která směřuje k Pneumocystis a vynikající citlivost ve srovnání s modifikovanou Wright stain a GMS skvrnu, ale jsou hlášeny na jeden falešně pozitivní výsledek, a proto mnohem vyšší specifičnost než popíšeme. Je možné, že s další praxí, jeden může snadněji rozpoznat charakteristické formy s Diff-Quik skvrny, čímž se zvýší citlivost tohoto testu., Podobně, snad s další zkušenosti s Merifluor Pneumocystis skvrnu, jeden by mohl naučit se lépe rozlišovat mezi true-pozitivní a falešně-pozitivní barvení, a tím snížit počet falešně pozitivních výsledků.

podle našich zkušeností mají skvrny Calcofluor white a GMS nejlepší parametry pro rutinní použití v klinické laboratoři. Přestože tyto testy byly méně citlivé než imunofluorescenční test, byly vysoce specifické a měly více než přijatelné pozitivní a negativní prediktivní hodnoty.,

• Copyright © 2004 American Society for Microbiology