Buněčné linie
HEK 293T buňky byly získány z American Type Culture Collection (ATCC CRL-3216). Myší hybridoma buněčné linie KT13 a KT22 byly získány z vývojových studií Hybridoma Bank (DSHB). Obě buněčné linie byly uloženy do DSHB tím, Kazumasa Takeda a Asako Sugimoto (DSHB hybridomu produkty KT13 a KT22)., Myší buněčnou linií hybridomu 5E4/1F1 laskavě poskytl Miha Kosmač a Vladka Čurin Šerbec (University of Ljubljana). HEK 293T a hybridomu buňky byly pěstovány v DMEM (Gibco) doplněné o 13% FBS (Gibco), 1× Penicilin/Streptomycin (Thermo Fisher), a 1× GlutaMAX (Gibco). Protilátky HC a LC sekvence z jednotlivých hybridomas byly stanoveny pomocí reverzní transkripce polymerázové řetězové reakce (RT-PCR) a kapilární sekvenování (Eurofins Genomika).,
Cycloheximide léčby a mikrosomů prokazují, příprava
Všechny pipetovací kroky byly prováděny na ledu a centrifugations byly prováděny při 4 °C pomocí Eppendorf 5810R centrifuga s pevným úhlem rotoru F-45-30-11. Protein LoBind 1,5 mL centrifugační zkumavky (Eppendorf) byly použity k minimalizaci buněčné adheze ke stěnám zkumavky. HEK 293T buňky (1 milion), myší buňky hybridomu (1 milion 5E4, KT13, a KT22 buňky smíchány v poměru 1:1:1), ARH-77 buňky leukémie (ATCC CRL-1621, 1 milion), nebo čerstvě izolovaných lidských CD19+ B buněk z pre – a post Td-booster imunizace vzorků (1.,5 milionů dolarů každý) byly resuspendovány v 1 mL PBS s 50 µg/mL cycloheximide a inkubovány 10 min na stánku ribozomy spojené s messenger Rna (mRNA) na drsné endoplazmatické retikulum. Buňky byly peletovaného s 300 g po dobu 10 min při 4 °C a promíchán pipetováním 15× nahoru a dolů v 120 µL high-density lyzačního pufru (25 mM HEPES-KOH, pH 7.2, 110 mM octan draselný, 5 mM, hořčík, acetát, 1 mM EGTA, 25% sacharosy , 5% glycerol, 1 mM 1,4-dithiothreitolu, 1× kompletní EDTA-free koktejl inhibitoru proteázy , 0,1 mg/mL cycloheximide, 0.015% digitoninového, a 400 Iu/mL RiboLock RNase inhibitor )., Buněčná a organellová lýza byla dokončena inkubací po dobu 10 minut na ledu. Každý homogenát byl rozdělen na dvě alikvoty 55 µL a přenesen do dvou zkumavek s čerstvými bílkovinami. Zkumavky byly odstředěny při 600 g po dobu 3 minut při 4 °C na jádra pelet a buněčné nečistoty. Celkem 40 µL supernatantu z každé zkumavky, obsahující membránové frakce a cytosolu, byly převedeny do čerstvé Protein LoBind trubky a koncentrace sacharózy byl zředěn na 0,37–0.40 M (12-13% w/w) přidáním 40 µL nuclease-free vody. Mikrosomy byly poté sedimentovány centrifugací s 20 800 g po dobu 120 minut při 4 °C., Cytosol-obsahující supernatanty byly vyřazeny a buněčné pelety byly resuspendovány pipetováním 10× nahoru a dolů v 85 µL promývacího pufru (25 mM HEPES-KOH, pH 7.2, 110 mM octan draselný, 2,5 mM, hořčík, acetát, 1 mM EGTA, 1 mM 1,4-dithiothreitolu, 1× kompletní EDTA-free koktejl inhibitoru proteázy, 0,1 mg/mL cycloheximide, 0.004% digitoninového, a 400 Iu/ml RiboLock RNase inhibitor). Mikrosomy byly opět sedimentovány centrifugací s 20 800 g po dobu 60 minut při 4 °C., Supernatanty byly zlikvidovány a mikrosomové pelety byly resuspendovány ve 20 µL promývacího pufru a udržovány na ledu až do dalšího použití.
Transmisní elektronové mikroskopie
alikvotní Vzorek 3,5 µL resuspendované HEK 293T mikrosomy byly použity čerstvě záře-vybitá Quantifoil sítí (Quantifoil, Německo) pokryta další 2 nm uhlíku podporu filmu a flash-zmrazené v kapalném ethanu pomocí Vitrobot píst (FEI). Vzorky byly naskenovány na Tecnai Spirit transmisní elektronový mikroskop (FEI) provozované na 120 kV vybaven 2 × 2 k Eagle CCD kamera (FEI)., Mikrografy byly zaznamenány za podmínek nízké dávky kryo při 42,000 × nominálním zvětšení (velikost pixelů v měřítku objektu: 5.2 Å/px) s použitím rozostření − 2 až − 4 µm. Sběr dat byl prováděn buď ručně, nebo zcela automaticky pomocí Leginonu .
Emulze RT-PCR montáž pomocí myši hybridomu mikrosomy
zředí 16 µL resuspendované mikrosomy ze smíšených hybridomas 5E4, KT13, a KT22 v 184 µL RT-PCR master mix obsahující 1× Verso 1-Step RT-PCR master mix (Thermo Scientific), 1× Verso enzyme mix (Thermo Scientific), 0.,5 µg/µL BSA, 100 µg/mL cycloheximide, a primery pro reverzní transkripci a HC a LC shromáždění (0,8 µM každého z primerů TitA_MID1_IgM_rev a TitB_MID12_IgK_rev; 0.16 µM každého z primerů OE_MHV_fwd a OE_MKV_fwd). Primer sekvence jsou uvedeny v Doplňující soubor 1: Obrázek s příponou S1a. Výsledný 200 µL vodného roztoku byly použity k vytvoření voda-olej emulze pomocí po kapkách kromě (13 alikvoty 15 µL v 30-sekundových intervalech) 800 µL olejové fáze podle Ge et al. (Minerální olej, Sigma M5904, s rozpětím 4,5% 80, Sigma S6760, 0,4% Tween 80, Sigma P8074 a 0.,05% Triton X-100, Sigma T8787) za stálého míchání na magnetickém míchadle., Šest alikvoty po 100 µL každého z výsledné emulze byly přeneseny do PCR zkumavek a podrobí se thermocycling následující podmínky: reverzní transkripce při 50 °C po dobu 15 min, RTase inaktivace při 95 °C po dobu 2 min, pak čtyři cykly denaturace při 95 °C po dobu 20 s, žíhání rampdown od 60 °C do 50 °C po dobu 50 s a extenze při 72 °C po dobu 1 min, pak 16 cyklů denaturace při 95 °C po dobu 20 s, žíhání při teplotě 60 °C po dobu 30 s a extenze při 72 °C po dobu 1 min, následuje závěrečné prodloužení kroku při 72 °C po dobu 5 min., Souběžně bylo provedeno Otevřené řízení RT-PCR zředěním 4 µL resuspendovaných mikrosomů v 46 µL RT-PCR master mix a termocycling reakce paralelně s emulzí RT-PCR. PCR shromáždění produkty byly extrahovány z emulze pomocí isobutanolu (2-Methyl-1-propanol, Sigma) a Zymo DNA Clean & Koncentrátor-5 kit (Zymo Research), jak bylo dříve publikováno . Výsledná DNA a produkt PCR z otevřené kontroly PCR byly načteny na 1, 2% gelu TBE-agarose a odděleny 90 V po dobu 60 minut., Montážní produkty o velikosti 800-950 bp byly vybrány z agarózového gelu a produkty byly získány pomocí Zymoclean gel dna Recovery kit. Montážní výrobky byly eluovány v 6 mM tris-cl pH 8 a skladovány při-20 ° C až do další analýzy.,
Nested PCR amplifikace myši hybridomu, montážní přípravky
Poté, emulze shromáždění reakce, montáž výrobků byl dále zesílen s adaptérem primery TitA_fwd, 5′ CGT ATC GCC TCC CTC GCG CCA TCA G 3′, a TitB_rev, 5′ CTA GCC TGC TTG CCA GCC, CGC TCA G 3′, pomocí Phusion high-fidelity DNA polymerase kit (Finnzymes) s následující thermocycling podmínek: Počáteční denaturace 98 °C 30 s, pak 15 cyklů denaturace 98 °C po dobu 7 s a žíhání/extenze při 72 °C po dobu 30 s, následuje závěrečné prodloužení kroku při 72 °C po dobu 5 min., PCR produkty byly čištěny pomocí Zymo DNA Clean & Concentrator-5 kit. Spojení HC a LC v sestavě produkty byly poté analyzovány pomocí PCR pomocí nested primery specifickými pro tři různé HC a tři různé LC (Další soubor 1: Obrázek S1e) pomocí Phusion high-fidelity DNA polymerase kit s následující thermocycling podmínek: počáteční denaturace 98 °C 30 s, pak 24 cyklů denaturace 98 °C po dobu 7 s a žíhání/extenze při 72 °C po dobu 30 s, následuje závěrečné prodloužení kroku při 72 °C po dobu 5 min., Vnořené produkty PCR byly naloženy na 1,2% TBE-agarózový gel a odděleny 90 V po dobu 40 minut. Real-time nested PCR pro kvantifikaci křížové kontaminace byla provedena v kopie se stejným nested primery pomocí SYBRGreen master mix (Applied Biosystems) na první krok qPCR cycler (Applied Biosystems) s následující thermocycling podmínek: počáteční denaturace při 95 °C po dobu 10 min, následuje 40 cyklů denaturace při 95 °C po 15 s žíhání při teplotě 56 °C po dobu 30 s a extenze při 72 °C po dobu 45 s., Počáteční abundances amplifikované montáž výrobků byly vypočteny pomocí 2^(-deltaCt) metoda a vynesou se jako sloupcové grafy s chybové úsečky znázorňující směrodatné odchylky od průměru.
imunizace a izolace CD19 + B buněk ze vzorků periferní krve
vzorky celé lidské periferní krve použité v této studii byly získány z in.vent Diagnostica GmbH jako vedlejší produkty z rutinních diagnostických postupů. v.,větrací Diagnostica GmbH má písemný informovaný souhlas od dárce k využití vedlejších produktů pro výzkum a etické schválení od Freiburg Etická Komise Mezinárodní (FEKI kód 011/1763) pro distribuci vzorků. Zdravý proband podstoupil booster očkování Tetanus Toxoid (TT)/Diptheria Toxoid (DT) (Td-pur®; 20 Mezinárodních jednotek TT a 2 IU DT; Novartis, Basilej, Švýcarsko)., K2-EDTA periferní krve získané z pre-očkování (den 0) a sedm dní po-Td booster imunizace byly použity k izolaci CD19+ B buněk pomocí CD19 pluriBead Oddělení Buněčné Kit (pluriSelect GmbH, Leipzig, Německo) podle instrukcí výrobce protokol. Izolované CD19+ B buněk pelety byly promyty v 1 mL studeného PBS a centrifugována při 300 g po dobu 10 min při 4 °C. Buněčné pelety odpovídající 1,5 milionu B buněk z obou pre – a post-očkování vzorky byly uchovávány na ledu, dokud cycloheximide léčby a mikrosomů prokazují, příprava.,
Emulze RT-PCR montáž pomocí lidských B buněk mikrosomy
Jsme přidali 2 µL zředěného mikrosomů připravených z mražených ARH-77 buňky (jako vnitřní párování ovládání) k 26 µL resuspendované mikrosomy z B buněk, a to jak pre – a post-Td očkování, tak, že konečný zlomek ARH-77 mikrosomů je 0,5% (v/v). Jsme zředěný 16 µL této suspenze mikrosomů v 184 µL RT-PCR master mix obsahující 1× dART 1-step RT-PCR master mix vyrovnávací paměti (Roboklon), 2× dART mistr směs enzymů (Roboklon), 0.,5 µg/µL BSA, 100 µg/mL cykloheximidu a primery pro reverzní transkripci (IgM, IgG a IgK) a sestavení těžkého (VH) a lehkého řetězce (VK). Základní sekvence a koncentrace v RT-PCR master mixu jsou uvedeny v dalším souboru 1: tabulka S2., Výsledný 200 µL vodného roztoku byly použity k vytvoření voda-olej emulze pomocí po kapkách kromě (13 alikvoty 15 µL v 30 s intervalech) 800 µL olejové fáze se skládá ze 73% emulze složka 1, 7% emulze složka 2, a 20% emulze složka 3 Micellula DNA emulze a čištění kit (Roboklon) za stálého míchání na magnetické míchačce., Šest alikvoty po 100 µL každého z výsledné emulze byly přeneseny do PCR zkumavek a podrobí se thermocycling následující podmínky: Reverzní transkripce při 55 °C po dobu 30 min, počáteční denaturace při 95 °C po dobu 3 min, pak tři cykly denaturace při 95 °C po dobu 20 s, žíhání při teplotě 56 °C po dobu 30 s a extenze při 72 °C po dobu 2 min, pak 20 cyklů denaturace při 95 °C po dobu 20 s, žíhání při teplotě 56 °C po dobu 30 s a extenze při 72 °C po dobu 4 min, následuje závěrečné prodloužení kroku při 72 °C po dobu 5 min., PCR shromáždění produkty byly extrahovány z emulze pomocí isobutanolu (2-Methyl-1-propanol, Sigma) a Zymo DNA Clean & Koncentrátor-5 kit (Zymo Research), jak bylo dříve publikováno . Výsledné DNAs byly naloženy na 1% TBE-agarózový gel a odděleny 100 V po dobu 45 minut. Montáž výrobků z 700 až 800 bp byly velikosti vybrané z agarózového gelu, obnovit pomocí Zymoclean Gel DNA Recovery kit, eluovány v 6 mM Tris-Cl pH 8, a skladovány při − 20 °C do další analýzy.,
Nested PCR amplifikace lidské B-buňky montážní přípravky
Pro další konkrétní zesílení HC-LC montáž výrobků, nested PCR amplifikace byla provedena s nested primery specifické pro IgM, IgG, a IGK konstantní regionů (Další soubor 1: Tabulka S2). PCR reakce obsahovala nested primery na 0,4 µM koncentrace 200 µM dNTP mix, 1× Q5 reakční pufr a 0,02 U/µL Q5 high-fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs) v reakčním objemu 50 µL 3 µL sestaven DNA., Nested PCR amplifikace byla provedena s následující thermocycling podmínek: počáteční denaturace 98 °C po dobu 3 min, pak 34 cyklů denaturace 98 °C 30 s a žíhání/rozšíření na 71 °C po dobu 1 min, následuje závěrečné prodloužení kroku při 72 °C po dobu 5 min. Vzorky byly odebrány po třech různých číslech cyklu PCR (28, 31 a 34 cyklů). Zesílené produkty PCR byly naloženy na 1% gelů TBE-agarose a odděleny 100 V po dobu 60 minut., Požadované výrobky z ~ 710 bp byly získány, jak je popsáno výše, sekvenování knihoven byly připraveny následující Illumina TruSeq DNA, příprava vzorků průvodce a 2 × 250 základnou spárováno-end čte byly sekvenovány pomocí Illumina MiSeq platformy.
Bioinformatická analýza párových protilátek těžké a lehké řetězce repertoáru
Demultiplexování 2 × 250 základnou spárováno-end čte z MiSeq sekvenování platforma byla provedena na základě adaptér indexy a sekvenční údaje byly získány ve fastq formátu., Pouze čte s minimálním skóre kvality Phred 10 přes 50% všech nukleotidů byly zachovány a naskenovány pro sekvence konstantní oblasti IgM, IgG a IgK. Přečtěte si dvojice chybí konstantní regionu sekvence zobrazení nebo HC-HC nebo LC-LC struktury byly odfiltrovány a zbývající čte byly převedeny do fastq formát a použít jako vstup pro analýzu s MiXCR (v1.2) pro vyrovnání čte reference V(D)J a C genových sekvencí z IMGT databáze , extrakce, a seskupování CDR-H3 nukleotidů (Další soubor 1: Tabulka S1)., HC-cdr3 sekvence obsahující frameshifts nebo stop kodony a s méně než dvěma čtení byly odfiltrovány. Vytvořili jsme soubor statistik párování HC-LC, který demonstruje spárované využití genů VH-VK v celkových spárovaných genových repertoirech HC-LC. Tepelné mapy byly generovány pomocí R a graficky zobrazeny pomocí ggplot2. Další, inter-individuální TT-specifické HC-CDR3 sekvencí byly identifikovány porovnáním HC-CDR3 sekvencí aminokyselin získaných z post-Td booster imunizace vzorku bylo oznámeno dříve TT-specifické HC-CDR3 sekvencí .,
PCR amplifikace full-délka HC a LC sekvence
Jsme navrhli dva-krok založené na PCR, amplifikační metody (Další soubor 1: Obrázek S5) začlenit omezení trávení lokalit potenciálně TT-specifické HC a LC s kompletní V(D)J genů sekvence. To umožnilo efektivní klonování HC a LC sekvencí do příslušných expresních vektorů a také produkci rekombinantních protilátek pro in vitro vazebné studie., Krátce jsme vybrali 14 spárované HC-LC CDR3 clonotypes získané z IgG sekvenování post-Td booster očkování na základě jejich frekvence, přesnost párování, a složit rozdíl mezi top1 LC-CDR3 a top2 LC-CDR3 spárované dané HC-CDR3 sekvencí. Extrahovali jsme celkovou RNA ze zmrazených B buněk izolovaných z post-TD booster imunizace pomocí trizolového činidla (Ambion) čištění podle pokynů výrobce. V prvním kroku bylo zesílení RT-PCR pro každý vybraný KLONOTYP HC – a LC-CDR3 provedeno samostatně pomocí 1-stupňové sady RT-PCR (Roboklon)., RT-PCR master mix (25 µL) obsahovala HC a LC V genu-specifické forward primery s BssHII omezení stránky převisy spolu s jednotlivými CDR3-specifické reverzní primery s 18 nukleotidy FR4 regionu na 0,4 µM koncentrace (Další soubor 1: Tabulka S3 a Obrázek S5), 1× dART 1-step RT-PCR master mix vyrovnávací paměti, 1× dART mistr směs enzymů, a 4,5 ng celkové RNA., Thermocycling podmínky byly následující: reverzní transkripce při 55 °C po dobu 30 min, počáteční denaturace při 95 °C po dobu 3 min, pak 23 cyklů denaturace při 95 °C po dobu 20 s, žíhání při teplotě 56 °C po dobu 30 s a extenze při 72 °C po dobu 90 s, následuje závěrečné prodloužení kroku při 72 °C po dobu 5 min. Produkty RT-PCR byly čištěny pomocí purifikační sady Agencourt AMPure XP – PCR (Beckman Coulter) podle pokynů výrobce a eluovány v 6 mM tris-Cl pH 8.0., Ve druhém kroku byly vyčištěné produkty RT-PCR použity jako šablona pro PCR amplifikaci pomocí Q5 high-fidelity DNA polymerázy (New England Biolabs). V nested PCR master mix (50 µL) obsahovala forward primery kódování BssHII omezení stránky a tři nukleotidy z PP nebo LC zárodečné linie sekvence genu spolu s reverzní primery obsahující kompletní FR4 regionu a NheI/HindIII omezení převisy na 0,4-µM koncentracích (Další soubor 1: Tabulka S3 a Obrázek S5), 4 µL purifikované DNA, 200 µM dNTP mix, 1× Q5 reakční pufr, a 0.,02 u / µL Q5 high-fidelity DNA polymeráza (New England Biolabs). Thermocycling podmínky byly následující: počáteční denaturace 98 °C po dobu 3 min, pak 16 cyklů denaturace 98 °C 30 s, žíhání na 69 °C po dobu 30 s a extenze při 72 °C po dobu 1 min, následuje závěrečné prodloužení kroku při 72 °C po dobu 5 min. PCR produkty byly rozděleny na TBE-agarózového gelu, full-délka HC a LC amplikony s omezením trávení stránky byly extrahovány z gelu pomocí Zymoclean Gel DNA Recovery Kit (Zymo Research) a výrobky byly skladovány při − 20 °C až do dalšího použití.,
Klonování a exprese rekombinantních monoklonálních protilátek
Omezení trávení plná délka HC a LC vložky a vyjádření vektorů (pCMV-CD30-4IE3_HC a pCMV-CD30-4IE3_LC) byla provedena restrikční enzymy BssHII, NheI a HindIII (New England Biolabs). Výsledné produkty byly naloženy na 2% TBE-agarózovém gelu a kapel ~ 5.9 kb pro HC vektor páteř, 5.3 kb pro LC vektor páteř, ~ 370 bp pro HC vložky, a ~ 340 bp pro LC vložky byly velikosti vybraných na agarózovém gelu a čistí, jak je popsáno výše., Ligací odpovídající vložky a vektorů pro zesílený HC a LC clonotypes byly provedeny pomocí instant sticky-konci DNA ligázy (New England Biolabs) a transformována do jednoho-shot chemicky kompetentní E. coli TOP10 buněk (IBA) podle pokynů výrobce. Plazmidové Dna byly izolovány z transformovaných kolonií (8-16 kolonie) pomocí QIAprep spin miniprep kit (Qiagen); podobnosti s konsenzus sekvencí byla potvrzena pomocí kapilární Sanger sekvenování., HC a LC plazmidové DNA sekvence, které odpovídá nejblíže k konsensus sekvence byly co-transfektovaly do lidských embryonálních ledvin buněčné linie HEK 293 T (ATCC, CRL-11268) buněk. HEK 293 T-buňky byly kultivovány pomocí bohaté glukózou (4.5 g/L D-glukózy) Dulbecco ‚s Modified Eagle‘ s Médiu (Gibco BRL) doplněná o tepelně inaktivované ultra-nízké IgG fetální bovinní sérum (Thermo Fisher Scientific), 100 U/mL penicilinu a 100 µg/mL streptomycinu. Přečištěné plazmidové Dna pro spárované HC a LC clonotypes byly co-transfektovaly do 85-95% konfluence HEK 293 T buněk pomocí PEI (polyethyleneamine, Polysciences)., Kultivační supernatanty byly shromážděny čtyři dny po transfekci a klonotypy specifické pro antigen tt byly identifikovány nepřímou ELISA.
enzymoimunoanalýzy (ELISA)
Jsme provedli nepřímé ELISA testy k identifikaci mAbs získané z imunizovaného proband vazba na TT antigen pomocí transfektovaly supernatanty buněčné kultury. Nunc-Immuno MicroWell 96-pevné desky (Thermo Fisher Scientific) byla potažena 100 µL 10 µg/mL TT antigen (Statens Serum Institut, Kodaň, Dánsko) v 50 mM uhličitanu buffer pH 9.,6, inkubovány přes noc při 4 °C, třikrát promyty PBS a blokovány s 2% nízkotučné sušené mléko (Bio-Rad) v PBS po dobu 150 min při pokojové teplotě. Po zablokování, 120 µL 1:2 sériově naředěn transfektovaly supernatanty v PTM (PBS, o 0,1% Tween-20, 2% nízkotučné sušené mléko) byly přidány do jamek, 350 ng myší anti-TT mAb (GeneTex) byl aplikován na jeden dobře jako pozitivní kontrola, a destičky byly inkubovány 1 h při pokojové teplotě. Desky byly třikrát omyty PBS-T (0.,1% Tween-20) a 50 µL 1:2000, ředění kozí anti-lidské kappa LC-HRP sekundární protilátka (Thermo Fisher Scientific) byly přidány do jamek, 50 µL 1:2000, ředění koza anti-myš IgG HC-HRP sekundární protilátka (Sigma #A0168) byly přidány do pozitivní kontroly dobře, destičky byly inkubovány po dobu 2 min při teplotě místnosti a promyje se třikrát pomocí PBS-T. Pro barvu rozvoj, přidali jsme 50 µL one-step Ultra TMB-substrát ELISA (Thermo Fisher Scientific) na jamku, inkubovat desky po dobu 5 min při teplotě místnosti, a zastavil Ag:Ab závazné reakce přidáním 50 µL 2 M H2SO4., Absorbance byla měřena při 450 nm pomocí systému GloMax Multi Detection System (Promega). ELISA testy pro všechny clonotypes byly provedeny v kopie, hodnoty byly normalizovány k odstranění pozadí signálů, a chyby byly zastoupeny jak standardní odchylky od průměru.
Analýza chimerická amplikonu formace během nested PCR
Čtyři definovanými HC-LC amplikony byly získány amplifikací HC a LC z příslušných pCMV plazmidů (viz výše) a pomocí PCR shromáždění reakce vytvoří čtyři odlišné HC-LC sestav., HC a LC plazmidové Dna byly použity jako šablony pro PCR amplifikace Top1, Top2 Top3, a Top4 klonální řetězec páry pomocí primerů specifických pro příslušné VH a VK genových rodin a IgG a IgK konstantní regionů (Další soubor 1: Tabulka S2 a Obrázek S6a). Přečištěné plazmidové DNA (10 ng) bylo přidáno do každé 25 µL PCR reakce obsahuje 0,4 µM každého primeru, 200 µM dNTP mix, 1× Q5 reakční pufr, 0,2 U/µL Q5 high-fidelity DNA Polymerázy., Tepelné cyklování bylo provedeno s počáteční denaturace 98 °C po dobu 3 min, následovalo 25 cyklů denaturace 98 °C 30 s, žíhání/rozšíření na 71 °C po dobu 1 min (pro HC plazmidové DNA) nebo žíhání na 64 °C po dobu 1 min a extenze při 72 °C po dobu 1 min (pro LC plazmidové DNA), následuje závěrečné prodloužení kroku při 72 °C po dobu 5 min. Výrobky PCR byly naloženy na samostatné 1% gely TBE-agarose a odděleny 100 V po dobu 60 minut. Požadované produkty DNA ~ 400 bp (pro HC) a ~ 350 bp (pro LC) byly vybrány a extrahovány z gelu, jak je popsáno výše., Vyčištěné produkty HC a LC PCR byly použity jako šablony pro montáž HC a LC překrytím rozšíření PCR (další soubor 1: obrázek S6b). Krátce, 5 ng každého VM a odpovídající párové LC DNA bylo přidáno do každé 50 µL PCR reakce obsahuje 1× dART 1-step RT-PCR master pufru (Roboklon), 2× dART mistr enzymu (Roboklon), a 0,4 µM každého IgG a IgK konstantní regionu primer (Další soubor 1: Tabulka S2)., Tepelné cyklování byla provedena s RT inaktivace při 95 °C po dobu 3 min, následovaly tři cykly denaturace při 95 °C po dobu 20 s, žíhání při teplotě 56 °C po dobu 30 s a extenze při 72 °C po dobu 2 min, následovalo 25 cyklů denaturace při 95 °C po dobu 20 s, žíhání při teplotě 56 °C po dobu 30 s a extenze při 72 °C po dobu 4 min, následuje závěrečné prodloužení kroku při 72 °C po dobu 5 min. Montážní výrobky byly naloženy na 1% gelů TBE-agarose a odděleny 100 V po dobu 45 minut. Montážní produkty ~ 750 bp byly vybrány a extrahovány z agarózového gelu, jak je popsáno výše., Individuálně sestavený HC-LC klonální páry byly sloučeny dohromady a použít jako šablonu pro nested PCR amplifikace s primery specifickými pro IgG a IgK konstantní regionů (Další soubor 1: Tabulka S2, Obrázek S6c). Vnořené PCR reakce a termické cyklistické podmínky byly stejné, jak je popsáno v části „vnořené PCR amplifikace lidských produktů pro montáž B buněk“, s výjimkou toho, že amplifikace PCR byla provedena po dobu 25 cyklů. Produkty PCR byly naloženy na 1% gelů TBE-agarose, odděleny 100 V po dobu 60 minut a požadované produkty ~ 720 bp byly extrahovány, jak je popsáno výše., Sekvenování knihoven z jednotlivých sestav a ze smíšených sestav po nested PCR byly připraveny následující Illumina TruSeq DNA, příprava vzorků průvodce a 2 × 250 základnou spárováno-end čte byly generovány pomocí Illumina MiSeq platformy.