RNA Sekvenování – Princip, Kroky, Metody A Aplikace

„RNA sekvenování je vysoká propustnost next-generation sekvenování metoda použitá pro analýzu genové exprese a transcriptomics studií.“

Ribonukleová kyselina je typ nukleové kyseliny většinově podílí na genové exprese, genové regulace a kódování/dekódování informací.

mRNA-messenger RNA je kódovací sekvence genu zapojeného do syntézy bílkovin, přibližně 4% RNA bazénu se skládá z mRNA, zatímco zbytek jsou nekódující RNA.,

ačkoli přibližně 90% RNA nekóduje, jsou důležité pro provádění různých funkcí.

například

• tRNA – přenáší aminokyselinu na ribozomální místo, zatímco překlad.
• rRNA-ribozomální RNA pomáhá v překladu.
• mikroRNA – genová exprese a regulace genové exprese.
• siRNA-chrání buňku před exogenními RNA.

mRNA je jednořetězcové nukleové kyseliny přepisu genu a z nichž protein je přeložen.,

mRNA nebo přepis obsahuje pouze kódující sekvence z genu. Má tedy pouze sekvence, které jsou vyžadovány při tvorbě bílkovin.

od nynějška lze analýzou mRNA určit expresní vzorec souvisejícího genu.

také celkové vyšetření RNA nám dává představu o tom, které geny jsou spojeny s tvorbou bílkovin a které nejsou.

znamená, že množství celkové RNA, mRNA a ncRNA může být určeno studiem celkové RNA.,

Transkriptomika je studium celé mRNA-často nazývané jako transkriptomy nebo celková RNA přítomná v buněčné nebo buněčné populaci.

analýzou transkriptomu buňky lze vyšetřit celou skupinu genové exprese. Jednou z důležitých technik používaných v transkriptomických studiích je sekvenování RNA.

transkriptom organismu je větší, složitější a nejistější, na rozdíl od genomu.

transkriptom se mění v jiném stavu a jiném prostředí., Životní styl, strava, cvičení, životní prostředí, podmínky a další vnější faktory hrají významnou roli v transkriptomové regulaci.

zde v sekvenování RNA je cDNA syntetizovaná z mRNA sekvenována a kvantifikována v sekvenceru. V tomto článku budeme diskutovat pouze o sekvenování RNA, ale předtím si přečtěte náš předchozí článek o transkriptomice: co je Transkriptomika?,

Princip RNA sekvenování:

RNA sekvenování je další generace, vysoký výkon RNA sekvenování a kvantifikace použité metody pro studium transcriptomics a genové exprese.

cDNA je konstruována z celkové mRNA procesem reverzní transkripce a fragmentována. Před provedením sekvenování se praktikuje simultánní ligace adaptéru a příprava knihovny.

sekvencer čte a kvantifikuje cDNA komplementární k mRNA.,

Steps in RNA-seq:

• RNA isolation
• cDNA synthesis
• Adaptor ligation
• Library preparation
• DNA fragmentation
• Sequencing
• Downstream applications

RNA isolation:

The first step in the RNA sequencing is the isolation of total RNA, mRNA or ncRNA for the experiment.,

izolace RNA je zdlouhavý proces ve srovnání s izolací DNA. RNA se může snadno rozpadat. Také šance na kontaminaci je vysoká v izolaci RNA.

proto je třeba věnovat zvláštní pozornost izolaci RNA a odborné ruce.

pro sekvenování RNA musí být vyžadována čistá rna s vysokým výtěžkem.

čistota a množství RNA se měří pomocí Nanodrop nebo qubit.

Note: for isolating mRNA from the total RNA pool, one additional step is required, using the oligo dT specific column in the purification or final step of elution, total mRNA can be isolated from the rest of RNAs.

nyní je náš vzorek RNA připraven na další krok.,

Reverzní transkriptázy PCR:

Další inovativní sada pro RNA sekvenování je udělat reverzní transkriptázy PCR, ve kterém je RNA reverzní přepisována do DNA.

pomocí speciálního typu polymerázy známé jako reverzní transkriptáza DNA se cDNA syntetizuje z mRNA.

Další informace o RT PCR zde: reverzní transkriptáza PCR.

syntéza cDNA druhého řetězce:

po cDNA syntetizované z mRNA je nutná syntéza DNA druhého řetězce. Za tímto účelem se PCR provádí pomocí normální Taq DNA polymerázy v konvenčním PCR.,

polymeráza přidává dNTPs do rostoucího řetězce DNA pomocí sady primerů.

Příprava knihovny:

první krok v přípravě knihovny nebo přípravě knihovny NGS začíná fragmentacemi.

použití speciálního typu restrikčních endonukleáz celá sada ds cDNA je roztříštěná pro NGS.

Poznámka:

knihovna přípravy se liší z platformy na platformách, jak některé fragmenty mRNA před provedením reverzní transkriptázy zatímco některé provést později, až po přípravu cDNA.,

v posledním kroku přípravy knihovny jsou konce ligovány sekvencemi adaptéru a zesíleny pro opravu konců. dA-tailing je volitelný v případě knihovny mRNA.

čištění knihovny:

celá knihovna se čistí pomocí připravené sady pro čištění DNA.

v posledním kroku je velmi důležité vyčistit celou knihovnu fragmentů, aby byla koncentrace knihovny hodnocena pomocí kvantitativního PCR nebo bioanalyzátoru.,

Poznámka:

Pro začátečníka si myslím, knihovny, příprava a DNA fragmentace je velmi těžké pochopit, takže si myslíme, že bychom měli napsat celý článek o Genomické DNA fragmentace, knihovna přípravy a její význam v NGS.

každopádně pojďme vpřed,

V dalším kroku je vzorek fragmentované DNA odeslán pro sekvenování.

sekvenování DNA:

nyní je vzorek sekvenován ve stroji NGS s vysokou propustností, který čte sekvenci a také kvantifikuje nukleovou kyselinu.,

chemie za sekvenováním cDNA závisí na tom, které platformy používáme, ačkoli široce používanou metodou je použití fluorescenční chemie.

v sekvenceru jsou jednotlivé fragmenty“ čteny “ samostatně a sekvenovány. Konečná data jsou zasílána do laboratoře bioinformatiky pro post-sekvenční analýzu.,

Different types of RNA and its function:

Abbreviation	RNA types	Function
mRNA	Messenger RNA	Codes for protein
tRNA	Transfer RNA	Transfer amino acid to the site of translation.,
rRNA	Ribosomal RNA	Catalyse the translation reaction
miRNA	microRNA	Gene regulation
siRNA	Smaller interfering RNA	Gene regulation and maintaining gene expression.
LncRNA	Long non-coding RNA	Transcriptional regulation and epigenetic regulations.,
snRNA	Small nuclear RNA	Helps in mRNA splicing and related functions
snoRNA	Small nucleolar RNA	Helps in RNA nucleotide modification
piRNA	Piwi-intercalating RNA	Function in defence against transposon; transposon defence system.
scaRNA	Small Cajal body-specific RNA	Also helps in nucleotide modifications (a type of snoRNA).,
shrna	malá vlásenka RNA	syntetická molekula RNA pomáhá při regulaci genů a kontrole genové exprese.

Transcriptome analýza dat:

Jeden z únavné práce, jak jsme již diskutovali v předchozím článku, je transcriptome analýza dat a interpretace výsledků. Data NGS jsou obrovská a složitější.,

Upřímně řečeno, výuka analýzy dat z transcriptomics není možné, člověk by měl mít, aby se hands-na praxi se učí, přesto se budu snažit, aby vás naučí, co je další v tomto procesu.

ve stroji se sekvenují různé fragmenty a shromažďují se data. V dalším kroku, založeném na lemující oblasti fragmentů, jsou uspořádány tzv.

V dalším kroku je transkriptom porovnán s referenční sekvencí nebo může být sestaven de novo.,

Celý transcriptome sequencing:

celý transcriptome buňky nebo tkáně – všechny Rna (mRNA, tRNA, rRNA, sncRNA, mikrorna a siRNA) jsou sekvenován a kvantifikovat. Jinými slovy, můžeme říci, že jak román, tak známé přepisy mohou být sekvenovány.

pro to je celá sada RNA extrahována ze vzorku tkáně.,

Cílové RNA sekvenování:

gen-konkrétní, shluk gen-konkrétní, cesta, konkrétní, nebo onemocnění související s transcriptomes jsou řazeny v určité cílové RNA sekvenování.

sekvenování cílové RNA je dostupnější a přesnější než celé sekvenování transkriptomu. Navíc je pro provedení experimentu zapotřebí menší množství vzorku RNA.

malé sekvenování RNA:

jednou z nejvíce se objevujících technik v sekvenování RNA je studium menší nekódující RNA buňky, protože ty jsou spojeny s tolika funkcemi v genomu.,

menší molekuly RNA, jako jsou miRNA, siRNA a piRNA, mohou být kvantifikovány a sekvenovány metodou sekvenování RNA založenou na NGS pro různé aplikace.

mRNA sekvenování:

sekvence celý přepis mRNA pomocí poly(a) tail selection používané pro studie genové exprese. Pomocí mRNA sekvenování známé, stejně jako nové změny přepisu mohou být detekovány.

výhody sekvenování RNA:

jednou z klíčových výhod sekvenování RNA není potřeba předchozí informace o sekvenci., Jak celý proces není založen na sondě na bázi chemie, předchozí sekvence informace pro navrhování sondy je zde není nutné.

lze provést přesnější a citlivější studii genové exprese.

širší dynamický rozsah.

Zachyťte známé i nové změny přepisu, i když nejsou k dispozici žádné informace o sekvenci.

přestože nejsou k dispozici žádné informace o referenční sekvenci, lze sekvenování RNA použít pro jakýkoli druh.

související: syntetický genom-metody, aplikace a výzvy.,

závěr:

přesvědčivě můžeme říci, že metoda RNA seq je pokročilejší a přesnější ve srovnání s mikroarray. Pomocí něj lze také objevit mutace de novo.