GLP-1 A SEKRECI INZULÍNU
Přehled ATP-senzitivní dráhy.
sekrece inzulínu stimulovaného glukózou (GSIS) je regulována řadou iontových a neiontových signálních drah, známých také jako katp-dependentní a nezávislé dráhy (34,35). KATP-dependentní mechanismus vazby stimulu a sekrece je přezkoumán na obr. 1., Β-buňka obecně přizpůsobuje sekreci inzulínu převládajícím hladinám glukózy v krvi metabolizmem glukózy. Při zvýšení hladiny glukózy se zvyšuje rychlost glykolýzy, která generuje substráty (hlavně pyruvát) pro mitochondriální oxidační metabolismus, jehož výsledkem je tvorba ATP nebo správněji zvýšení poměru ATP-ADP (36). Tato událost poskytuje funkční spojení mezi glukózovým podnětem a sekrecí inzulínu., Zvýšení v tomto poměru způsobuje uzavření β-buněk KATP kanálů, což vede k depolarizace plazmatické membrány, aktivaci napěťově závislých Ca2+ kanálů (VDCCs), a zvýšení intracelulární koncentrace Ca2+ (i), hlavním podnětem pro sekreci inzulínu. Repolarizace β-buněk je pravděpodobně zprostředkován napěťově závislé K+ (Kv) kanály a Ca2+-citlivé napěťově závislé K+ (KCa) kanály (37), které se otevírají v reakci na glukózu-indukované depolarizace obnovit vnější tok K+., GLP – 1 se navrhuje modulovat GSIS regulací aktivity několika iontových kanálů zapojených do sekrece inzulínu závislého na KATP a kroky distální k modulaci kanálů.
GLP-1 a β-buněčné KATP kanály.
jedním z mnoha pozorovaných buněčných účinků GLP-1 je inhibice β-buněčných KATP kanálů (38-40). Výsledná membránová depolarizace indukovaná uzavřením KATP kanálu iniciuje příliv Ca2+ prostřednictvím VDCCs a spouští exocytotické uvolňování inzulínu., Obrázek 2 ukazuje excitační účinek GLP-1 na membránový potenciál a jeho inhibiční účinek na obou nativní KATP kanálu proudy z IN-1 buněk a proudy zprostředkované rekombinantním KATP kanály (SUR1/Kir6.2) coexpressed s GLP-1 receptorů v savčích buněčných linií. Fyziologické důsledky GLP-1, který zprostředkovala KATP kanálu uzavření by bylo 1) rozšířit dráždivost buněk již výše práh pro uvolňování inzulínu a 2) zvýšit podíl β-buňky aktivně vylučovat inzulín v koncentraci glukózy normálně udržovací funkce pro uvolňování inzulinu.,
konsensuální názor je, že inhibiční účinek GLP-1 na KATP kanálů je cAMP/PKA dependentní (38-41), i když jedna studie pomocí krysa β-buněk nesouhlasí (42). Toto tvrzení Suga et al. (42) vychází z jejich zjištění, že specifický inhibitor pKa RP-cAMPS (100 µmol/l) nebyl schopen zabránit buněčné depolarizaci a snížení CELOBUNĚČNÉHO katp proudu vyvolaného GLP-1. Úplnost inhibice pKa pomocí RP-táborů by měla být zpochybněna, protože ve stejné studii forskolin vyvolal významnou sekreci inzulínu i v přítomnosti RP-táborů. Za druhé, Suga et al., naznačují, že GLP-1 způsobuje mírné zvýšení citlivosti ATP kanálu KATP tak, že při nízkých koncentracích mikromolárního ATP bude kanál KATP náchylnější k uzavření. Nicméně, v normální krysa pankreatické β-buňky, millimolar hladiny ATP jsou přítomny (43), a na tyto fyziologické úrovně ATP, velmi podobné KATP kanál je otevřený pravděpodobnosti (Po) v nepřítomnosti a přítomnosti GLP-1 jsou předpokládané takto. Naše výpočty ukazují, že při intracelulárním množství 2 mmol / l je KATP kanál po snížen z 0,005 na 0,003 za přítomnosti GLP-1., Je pravděpodobné, že v přítomnosti GLP-1 dochází k levému posunu citlivosti ATP. Pozorovaná velikost proudu KATP indukovaného GLP-1 je však pozorována u nahrávek patch-clamp s celobuněčnými svorkami (obr. 2) je pravděpodobně příliš velký na to, aby byl účtován pouze malým poklesem Po vypočteným z údajů Suga et al. (42). Poslední práce z naší laboratoře ukázaly, že membrána-permeant konkrétní PKA inhibitor H-89 (44) je schopen zcela inhibuje KATP aktuální snížení GLP-1 (45)., Navíc, další ukázaly podobné výsledky pomocí Rp-8-Br-tábory, více membrána-propustná analogové Rp-tábory (38,41). Akce GLP-1 na KATP kanálů, může také zahrnovat jiné signální dráhy, protože KATP kanálu inhibice GLP-1 v myší β-buněk bylo prokázáno, že kalmodulin dependentní, pomocí kalmodulin inhibitory W-7 a calmidazolium (46).
glukóza závislost GLP-1 akce byla dobře zavedená, ačkoli přesné mechanismy této závislosti jsou nejasné (41,47)., Buněčné působení PKA na katp kanálu však může poskytnout spojení mezi touto kinázou a glukózovou citlivostí GLP-1. Jiné skupiny ukázaly, že přidání katalytické podjednotky PKA (cPKA) do vyříznutých náplastí obsahujících KATP kanály vede k rozšíření katp proudu (39,48). Naše laboratoř nedávno ukázala, že vliv cPKA na katp proud je závislý na ADP (45). Když jsou hladiny ADP zvýšeny, cPKA zvyšuje katp kanálový proud v rekombinantním systému, v souladu s výsledky Lin et al. (39)., Naopak, jak se hladiny ADP snižují, cPKA snižuje katp proud (45). Fyziologicky, to může mít za následek nepatrné zvýšení β-buněk dráždivost když hladina glukózy v krvi je nízká (vysoká ), vzhledem k tomu, když hladina glukózy v krvi stoupat (nízká ), GLP-1-zprostředkované uzavření KATP kanály, prostřednictvím PKA-dependentní cesta, vede k depolarizace a následné zvýšení β-buněk dráždivost., Zvláštní pozornost musí být věnována buněčné ATP na ADP poměr při zvažování KATP kanálu činnost, protože to je změní v tomto poměru, více než jen změny v intracelulární per se, které upravují činnost KATP kanálů v neporušené β-buněk. Zdarma ATP je vysoce pufrované uvnitř buněk membránovou a cytosolickou ATPases (43) a předpokládá se významně nezměnil se zvýšenou metabolismu glukózy (36). Naproti tomu reciproční změna ADP, která není ve stejném rozsahu vyrovnána, je významnější a vede ke změně poměru ATP-to-ADP (36)., Význam ADP při kontrole aktivity katp kanálu β-buněk byl skutečně prokázán, protože mutace v oblasti ADP snímání lidského KATP kanálu vedou k nekontrolované sekreci inzulínu a hypoglykémii (49). Molekulární identita místa (y) fosforylace pKa má významný význam a je stále předmětem šetření. Oba Kir6.,2 a SUR1 podjednotky KATP kanál obsahovat domnělé cílové sekvence pro PKA-zprostředkovaná fosforylace (39,48), a systematické mutace těchto zbytků by měla objasnit relativní příspěvky z těchto stránek působení PKA na KATP kanálu.
obchody GLP-1, VDCCs a intracelulární Ca2+.
GLP-1 bylo prokázáno, že zvýšení proudy přes VDCCs v myš, krysa, a lidský β-buněk (38,50–52), i když velikost tohoto efektu se liší a často nedosahuje statistické významnosti., V jeden lidský β-buněk, GLP-1 bylo prokázáno, že zvýšení L-typ VDCC aktivity a amplituda depolarizace-evokované intracelulárního vápníku přechodných jevů, vliv, což představovalo 40% nárůst GLP-1-umocněným exocytóza (52). I když L-typ VDCCs jsou klasicky považovány za hlavní regulátory Ca2+ influx vede k sekreci inzulinu, β-buňky jsou známé vyjádřit více Ca2+ kanál izoformy (53). Pereverzev et al. (54) nedávno oznámil, že myši postrádající a1E-izoforma Cav2.3 mají sníženou toleranci glukózy a snížení inzulínové odpovědi na glukózu., Spekulují, že G-proteinová regulace tohoto kanálu může modulovat sekreci inzulínu na základě regulace Muskarinového acetylcholinového receptoru VDCCs in vitro (55).
u inzulinomových buněk HIT-T15 transfekovaných receptorem GLP-1 jsme zjistili, že GLP-1 způsobuje zvýšení napěťově závislých Ca2+ proudů (viz 56 a obr. 3A). To je způsobeno alespoň částečně levým posunem v závislosti na napětí aktivace připomínající účinek fosforylace VDCC PKA (57,58)., Také jsme pozorovali doprava posun v napětí závislost rovnovážného stavu inaktivace taková, že v přítomnosti GLP-1, méně kanály byly účinně inaktivovány v daném hospodářství potenciál (50). To je podporováno Britsch et al. (50), kteří naznačují, že léčba β-buněk myší GLP-1 zpomaluje inaktivaci proudů Ca2+ závislých na napětí. GLP-1 navíc vedl ke zvýšení intracelulárního vápníku až po přidání glukózy, což je účinek, který byl částečně blokován antagonisty VDCC (obr. 3C)., Schopnost GLP – 1 zvýšit proudy Ca2+ je, stejně jako účinek na KATP kanály, závislá na táboře (51,52), založená na schopnosti RP-táborů zabránit zvýšení proudů. Ve skutečnosti, léčba potkanů β-buňky s dibutyryl cyklický AMP, membrána-propustná tábor analogové, replikované účinek GLP-1 na Ca2+ proudy (51)., Navíc, v našich studiích (56), VDCC reakci na GLP-1 byl ztracen v HIT-T15 buněk exprimujících mutantní GLP-1 receptor chybí kritické zbytky potřebné pro připojení k adenylyl cyklázy, vzhledem k tomu, že VDCC činnost by mohla být ještě posílena tím, že tábor nezávislé agonista BAYK8644. Nedávné důkazy naznačují, že A-kinázy ukotvení proteinu (AKAP), AKAP18, cíle PKA na VDCCs a že tato kináza může být zapojen v GLP-1 modulace z těchto kanálů (59).,
kromě účinků na VDCCs, GLP-1 může mobilizaci intracelulárního vápníku obchodech v tábor-závislým způsobem (60,61), případně přispět k oscilační jsem reakci na GLP-1 viděn v HIT-T15 buněk (Obr. 3C) (62). Naše studie ukazují, že GLP-1 aplikace následek oscilace v i v HIT-T15 buňky a že tyto oscilace nejsou zrušeny (i když jsou snížené amplitudy) odstranění extracelulárního Ca2+ nebo VDCC blokáda (Obr. 3C)., V řadě typů buněk jsou oscilace Ca2 + vyvolané agonistou primárně způsobeny uvolněním Ca2+ prostřednictvím inositol trisphosphate (IP3) a/nebo ryanodin-citlivých obchodů (63-65). V β-buňkách, GLP-1 mobilizuje Ca2+ obchody z velké části tím, senzibilizující ryanodine receptor (pravděpodobně typ 2 izoformy, RYR-2) proces Ca2+-indukované Ca2+ uvolnění (CICR) (61,66). Několik studií prokázalo, že GLP-1 může zvýšit i nezávislým způsobem pKa (67-69)., Tento mechanismus byl nedávno připsal CICR z ryanodine-citlivé obchody prostřednictvím cAMP-regulovaný guanin nukleotid výměnný faktor II (GEF-II nebo Epac2) a jeho interakce s Ras-související malé G-proteinu Rap1 nebo s Rab3 malých G-proteinů efektorové Rim2 (68). Význam tábora-GEF-II-Rim2 byla prokázána, protože inaktivace tohoto komplexu (pomocí antisense oligonukleotidů nebo mutantní konstrukty) oslabené sekreční reakce myši ostrůvků nebo MIN6 inzulinomu buňky GLP-1 (67)., Protože afinita tábor pro PKA je mnohem vyšší (∼100 nmol/l) ve srovnání s cAMP-GEF-II (∼10 mmol/l), je zajímavé spekulovat, že GLP-1-stimulované cAMP-GEF-II cestu, by mohly působit na růst v místní tábor, spíše než globální změny., I když GLP-1 receptor signalizační stimuluje IP3 produkce GLP-1 receptoru-vyjádření, PROTOŽE buňky (70), role pro IP3-citlivé Ca2+ obchody v globálním jsem je na pochybách, protože GLP-1-stimulované produkce IP3 v primární β-buněk je údajně minimální (71,72) a IP3 receptorů xestospongin C se nepodařilo zablokovat uvolnění intracelulárního Ca2+ obchody tím, že forskolin léčby (68). Studie Nakagaki et al však naznačují uvolňování Ca2 + regulovaného IP3 z inzulínových granulí., (62), kteří naznačují, že GLP-1 může jedinečně regulovat Časové a prostorové uvolňování intracelulárního vápníku prostřednictvím lokální signalizace IP3. Tak, GLP-1-zprostředkované uvolnění intracelulární obchody, spolu s potenciace Ca2+ vstup přes VDCCs, pravděpodobně přispívají k insulinotropic účinek GLP-1.
GLP-1 a β-buněčné Kv kanály.
proudy závislé na napětí k+, jako jsou proudy zprostředkované kanály Kv nebo KCa, zprostředkovávají repolarizaci β-buněk po depolarizačním stimulu, jako je glukóza (37)., Nedávno jsme informovali, že Kv1 a Kv2 rodiny kanály regulují sekreci inzulínu, protože dominantní negativní funkční knockout jedné z těchto kanálů rodiny rozšířené GSIS (73). Kv2.1 kanály zprostředkovávají většinu tohoto efektu (>60%), mechanismus, který zahrnuje zvýšenou glukózou-stimulované depolarizace a Ca2+ vstup (nepublikované pozorování). Protože β-buněk Kv, proudy jsou silné glukózo-dependentní regulátory sekrece inzulínu, domnívali jsme se, že fyziologické antidiabetik, jako GLP-1 může regulovat Kv kanál funkce., Skutečně jsme zprávu, jinde v této doplnit, že GLP-1 receptor agonista exendin 4 inhibuje napěťově závislé ven K+ proudy u potkanů β-buňky napětí-upnuté v whole-cell konfiguraci o 40% a výrazně prodlužuje časový průběh β-buněk repolarizace po přechodné depolarizace aktuální injekce. To se porovnává s 86% snížením vnějších k+ proudů dosažených s obecným antagonistou kanálu Kv tetraethylamonium. GLP – 1 antagonizoval napěťově závislé vnější k + proudy v potkaních β-buňkách v nepřítomnosti glukózy., Tento účinek však může stále přispívat k glukózové závislosti inzulinotropního účinku GLP-1, protože se obvykle neočekává, že kanály Kv budou aktivní až po depolarizaci buněčné membrány indukované glukózou (37). Navíc, a podobně jako účinek GLP-1 na ostatní výše uvedené iontové kanály, je exendinová 4-zprostředkovaná inhibice β-buněčných Kv kanálů závislá na cAMP signalizaci. Jedna nedávná studie však naznačila, že cAMP signalizace sama o sobě nestačí k antagonizaci proudů závislých na napětí v buněčné linii vylučující inzulín (INS-1) (74).,
četné studie popsaly účinky hormonálně zprostředkovaných změn v napěťově závislých proudech k+, jak excitačních, tak inhibičních. Nejlépe charakterizované těmito účinky je napěťově závislá k+ proudová downregulace v lymfocytech a upregulace v srdečních myocytech (75,76). V obou těchto tkáních byla signalizační dráha cAMP/PKA zapojena do regulace těchto kanálů (76,77)., Zprávy naznačují, že tábor může snížit napěťově závislé K+ proudy v myších lymfocytů (76) a hypofyzární buněčné linie (78), ale zvýšení napětí závislé K+ proudy v srdečních myocytů (77), zjištění, že byla potvrzena v single-channel úrovni v žábu fibrilace myocytů (79) a obří chobotnice axon (80)., Fosforylace se může objevit přímo na kanálu, protože PKA fosforylace fibrilace Kv kanálu v blízkosti NH2-konci rozšířeného kanálu činnost (81), a fosforylace Kv1 kanál α-podjednotky upravuje rozsah inhibice těchto kanálů udělených regulačními β-podjednotky (82). Fosforylace samotných β-podjednotek může také modulovat regulační interakci s pórovitými α-podjednotek (83). Nedávno bylo prokázáno, že regulace srdečního Kv kanálu (KvLQT) cAMP vyžaduje vyjádření AKAP15/18 nebo AKAP79 (84)., Navíc, zvýšení napětí-dependentní K+ proud je zapojen do adrenalinem-indukované inhibice glukózo-dependentní zvýšení i v ob/ob a +/+ myši β-buněk (85), protože efekt byl obrácen tetraethylamonium. Zajímavé je, že inhibiční účinek epinefrinu na i byl také obrácen aktivátorem adenylyl cyklázy forskolin (85). Proto se domníváme, že existují důkazy, které naznačují, že hormonální modulace Kv proudů je fyziologicky důležitá. Konkrétně se očekává, že inhibice GLP-1 těchto proudů povede ke zvýšené excitabilitě β-buněk.,
GLP-1 a další iontové kanály β-buněk.
zvýšení intracelulárního cAMP je již dlouho známo, že zvyšuje na + proudy (86), což je účinek, který může být zprostředkován fosforylací přímého kanálu PKA (87). Přechodná reakce na + proud na cAMP byla poprvé popsána v neuronech gastropodu a nazývána INa (cAMP) (88)., V inzulín-vylučovat buňky, RNA výraz neselektivní kationtové geny mSTRPC4 a LTRPC2 byl nedávno zjištěn v inzulinomu buněk a lidských ostrůvků, respektive (89), a tábor byl hlášen k indukci genové exprese mNSC1, který kóduje myš nespecifický kationtový kanál (NSCC) (90). Předpokládá se, že GLP-1 zvyšuje NSCC nesoucí převážně na+ proudy (91,92). Tento účinek nastává aktivací cAMP signalizace GLP-1 a uvolněním intracelulárních Ca2+ obchodů a může sloužit jako další důležitá modulační cesta pro GLP-1 v β-buňce (40)., Není jasné, zda NSCCs aktivován GLP-1 odpovídají neselektivní kationtový proud vyrábí aktivace Ca2+-sensing receptor (93), ale ten účinek je hlásil, že nebude zahrnovat aktivaci Gs podjednotky, a mohou proto zahrnovat cAMP/PKA dráhy.
o účincích GLP-1 na jiné iontové kanály je málo známo. V buňkách vylučujících inzulín byly detekovány proudy Cl aktivované otoky buněk (94), ale role těchto kanálů v sekreci inzulínu je nejasná., Kanály Cl, jako je transmembránový regulátor vodivosti cystické fibrózy a navenek usměrňující kanály Cl, jsou aktivovány signalizací cAMP/PKA (95). Pokud se vyskytne v β-buňce, měl by tento účinek tendenci podporovat depolarizaci. Jedna zpráva naznačuje, že GLP-1 aktivuje Ca2+-citlivé Cl− proud v oocytů Xenopus vyjadřující GLP-1 receptor (96), efekt, který byl závislý na Ins(1,4,5)P3-dependentní intracelulární Ca2+ mobilizace (96). Zbývá však určit, zda GLP-1 může stimulovat Cl proudy v buňkách vylučujících inzulín.
GLP – 1 a exocytóza.,
glukóza může mít stimulační účinek na exocytózu inzulínu, nezávisle na jeho dobře charakterizovaných účincích iniciovaných inhibicí KATP kanálů. Význam této dráhy může být částečně realizován skutečnost, že myši s cílené narušení v KATP (Kir 6.2 nebo SUR1) nezobrazují zjevné abnormality glukózové tolerance (97,98). KATP-nezávislé sekrece inzulínu není dobře rozuměl, a je myšlenka zahrnovat několik signálů, které působí na neiontové cíle, zejména distální kroky exocytóza., Bylo navrženo, že pro tento stimulační účinek je nutný metabolismus glukózy a že pravděpodobné signály zahrnují ATP, cAMP, glutamát a malonyl-CoA (rev.v 99 a 100). Vzhledem k tomu, že ATP, cAMP a PKA jsou zapojeny v exocytotic proces, je pravděpodobné, že GLP-1 může mít účinky distální akce na iontových kanálů, dále rozšiřovat sekreci inzulínu. Je dobře známo, že akce, které potlačují GLP-1 indukované tábor akumulace a aktivace PKA potlačení sekrece inzulínu, což naznačuje, že tábor a/nebo PKA jsou věrohodné efektory (101)., V myších β-buňkách lze působením na stimulační sekreci (102) zaznamenat pouze zlomek exocytózy. Ze studií, které ukazují, že cAMP indukuje sekreci v přítomnosti nízkého a vysokého i, se navrhuje, aby cAMP senzibilizoval exocytotické stroje. Studie využívající fotoreleasovatelné inhibitory cAMP a pKa ukazují, že cAMP evokuje pKa závislé a nezávislé účinky na exocytózu. Zdá se, že zvýšení cAMP, nezávislé na aktivaci PKA, urychluje exocytózu snadno uvolnitelného bazénu v β-buňkách (103)., PKA-dependentní mobilizace sekreční granule, na rozdíl od generace tábor sám, zdá se, vyžaduje metabolismus glukózy (zvýšená ATP/ADP) a zahrnuje translokaci granulí (103,104). Takový účinek by zvýšil velikost snadno uvolnitelného bazénu, zvýšil rychlost doplňování bazénu a zvýšil exocytózu. Vzhledem k tomu, že GLP-1 může zvýšit jak cAMP, tak PKA, lze z těchto údajů vyvodit účinky na exocytózu., Existuje několik potenciálních cílových proteinů pro působení GLP-1, včetně proteinů n-ethylmaleimidu citlivých na β-buňky (SNARE) (105).
GLP-1 a intracelulární energetická homeostáza.
Nedávné studie v klonální β-buněk naznačují, že insulinotropic akce GLP-1 jsou v části zprostředkovaná PKA-dependentní stimulaci hormon-senzitivní lipáza (HSL) (106). To je navrhl, že lipolytické činnosti GLP-1 vyvolat rozpad trigycerides do volných mastných kyselin v β-buňkách, které jsou pak převedeny na dlouho-řetěz CoA., Zvýšení volných mastných kyselin by pak mohly poskytnout substrát pro mitochondriální oxidace a produkci ATP, což vede k větší nárůst intracelulární ATP-ADP poměr a dále inhibice KATP kanály. Navíc, protože ATP může sám ovlivnit exocytóza, některé z akcí, GLP-1 může být cíl distální kroky exocytóza, jak je uvedeno výše. V několika studiích bylo prokázáno, že ATP výrazně usnadňuje exocytózu nezávislou na buněčné depolarizaci, ale je závislá na Ca2+ (99)., Další potenciální mechanismus by tedy mohl vysvětlit sekreci inzulínu indukovanou GLP-1.