Zelllinien
Die HEK 293T-Zelllinie wurde aus der American Type Culture Collection (ATCC CRL-3216) erhalten. Maus-Hybridom-Zelllinien KT13 und KT22 wurden aus den Entwicklungsstudien Hybridom Bank (DSHB) erhalten. Beide Zelllinien wurden von Kazumasa Takeda und Asako Sugimoto (DSHB Hybridoma Produkte KT13 und KT22) an der DSHB abgelagert., Die Maushybridomazelllinie 5E4 / 1F1 wurde freundlicherweise von Miha Kosmač und Vladka Čurin Šerbec (Universität Ljubljana) zur Verfügung gestellt. HEK 293T-und hybridoma-Zellen wurden in DMEM (Gibco), ergänzt mit 13% FBS (Gibco), 1× Penicillin/Streptomycin (Thermo Fisher) und 1× GlutaMAX (Gibco). Antikörper-HC – und LC-Sequenzen aus einzelnen Hybridomen wurden durch Reverse Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) und Kapillarsequenzierung (Eurofins Genomics) bestimmt.,
Cycloheximidbehandlung und Mikrosomenvorbereitung
Alle Pipettierungsschritte wurden auf Eis durchgeführt und Zentrifugationen bei 4 °C mit einer Eppendorf 5810R Zentrifuge mit Festwinkelrotor F durchgeführt-45-30-11. Protein LoBind 1,5 ml Zentrifugenröhrchen (Eppendorf) wurden verwendet, um die Zelladhäsion an den Röhrenwänden zu minimieren. HEK 293T-Zellen (1 Million), Maus-Hybridomzellen (1 Million von 5E4 -, KT13-und KT22-Zellen im Verhältnis 1:1:1 gemischt), ARH-77-Leukämiezellen (ATCC CRL-1621, 1 Million) oder frisch isolierte humane CD19+ B-Zellen aus Prä-und Post-Td-Booster-Immunisierungsproben (1.,Jeweils 5 Millionen) wurden in 1 ml PBS mit 50 µg/ml Cycloheximid resuspendiert und 10 min inkubiert, um Ribosomen mit assoziierten Messenger-RNAs (mRNA) im rauen endoplasmatischen Retikulum zu stoppen. Die Zellen wurden mit 300 g für 10 min bei 4 °C granuliert und durch Pipettieren von 15× auf und ab in 120 µL hochdichtem Lyspuffer (25 mM HEPES-KOH pH 7.2, 110 mM Kaliumacetat, 5 mM Magnesiumacetat, 1 mM EGTA, 25% Saccharose , 5% Glycerin, 1 mM 1,4-Dithiothreitol, 1× vollständiger EDTA-freier Proteaseinhibitorcocktail , 0,1 mg/ml Cycloheximid, 0,015% Digitonin und 400 U/ml RiboLock-RNase-Inhibitor) resuspendiert.., Zelle und Organellen-Lyse wurde durch Inkubation für 10 min auf Eis. Jedes Homogenat wurde in zwei 55 µL Aliquots aufgeteilt und in zwei frische Protein-LoBind-Röhrchen überführt. Die Röhrchen wurden bei 600 g für 3 min bei 4 °C zentrifugiert, um Kerne und Zellreste zu pelletieren. Insgesamt wurden 40 µL Überstand aus jeder Röhre, die Membranfraktionen und Cytosol enthielten, in frische Proteinlappenröhrchen überführt und die Saccharosekonzentration wurde durch Zugabe von 40 µL nucleasefreiem Wasser auf 0,37–0,40 M (12-13% w/w) verdünnt. Die Mikrosomen wurden dann durch Zentrifugation mit 20.800 g für 120 min bei 4 °C sedimentiert., Die cytosolhaltigen Überstände wurden verworfen und Membranpellets wurden durch Pipettieren von 10× auf und ab in 85 µL Waschpuffer resuspendiert (25 mM HEPES-KOH pH 7.2, 110 mM Kaliumacetat, 2,5 mM Magnesiumacetat, 1 mM EGTA, 1 mM 1,4-Dithiothreitol, 1× vollständiger EDTA-freier Proteaseinhibitorcocktail, 0,1 mg/ml Cycloheximid, 0,004% Digitonin und 400 U/ml RiboLock-RNase-Inhibitor). Die Mikrosomen wurden erneut durch Zentrifugation mit 20.800 g für 60 min bei 4 °C sedimentiert., Überstände wurden verworfen und die Mikrosomenpellets in 20 µL Waschpuffer resuspendiert und bis zur weiteren Verwendung auf Eis gehalten.
Transmissionselektronenmikroskopie
Proben-Aliquots von 3,5 µL resuspended HEK 293T-Mikrosomen wurden auf frisch entladene Quantifoil-Gitter (Quantifoil, Deutschland) aufgebracht, die mit einem zusätzlichen 2-nm-Kohlenstoff-Trägerfilm bedeckt und mit einem Vitrobot-Kolben (FEI) in flüssigem Ethan flashgefroren waren. Die Proben wurden auf einem mit 120 kV betriebenen Tecnai Spirit Transmission Electron Microscope (FEI) abgebildet, das mit einer 2 × 2 k Eagle CCD-Kamera (FEI) ausgestattet war., Mikrographen wurden unter Kryo-niedrigdosierten Bedingungen bei 42.000× nominaler Vergrößerung (Pixelgröße im Objektmaßstab: 5.2 Å/px) mit einem Defokus von − 2 bis − 4 µm aufgenommen. Die Datenerfassung erfolgte entweder manuell oder vollautomatisch mit Leginon .
Emulsion RT-PCR-Montage mit Maus-hybridoma-Mikrosomen
Wir verdünnten 16 µL resuspendiert Mikrosomen aus gemischten hybridomas 5E4, KT13, und KT22 in 184 µL RT-PCR-master-mix enthält 1× Verso 1-Step RT-PCR master mix (Thermo Scientific), 1× Verso Enzym-mix (Thermo Scientific), 0.,5 µg / µL BSA, 100 µg / mL Cycloheximid und Primer für Reverse Transkription und HC-und LC-Assembly (jeweils 0,8 µM Primer TitA_MID1_IgM_rev und TitB_MID12_IgK_rev; jeweils 0,16 µM Primer OE_MHV_fwd und OE_MKV_fwd). Primersequenzen sind in zusätzlicher Datei 1 dargestellt: Abbildung S1a.Die resultierenden 200 µL wässriger Lösung wurden verwendet, um eine Wasser-in-Öl-Emulsion durch tropfenweise Zugabe (13 Aliquots von 15 µL in 30-s-Intervallen) zu 800 µL Ölphase gemäß Ge et al. (Mineralöl, Sigma M5904, mit 4,5% Spannweite 80, Sigma S6760, 0,4% Tween 80, Sigma P8074 und 0.,05% Triton X-100, Sigma T8787)während kontinuierlichen Rührens auf einem Magnetrührer., Sechs Aliquots von je 100 µL der resultierenden Emulsion wurden in PCR-Röhrchen überführt und unter folgenden Bedingungen Thermocycling unterzogen: umgekehrte Transkription bei 50 °C für 15 min, RTase-Inaktivierung bei 95 °C für 2 min, dann vier Zyklen der Denaturierung bei 95 °C für 20 s, Glührampdown von 60 °C auf 50 °C für 50 s und Verlängerung bei 72 °C für 1 min, dann 16 Zyklen der Denaturierung bei 95 °C für 20 s, Glühen bei 60 °C für 30 s und Ausdehnung bei 72 °C für 1 min, gefolgt von einem letzten Verlängerungsschritt bei 72 °C für 5 min., Parallel dazu wurde eine offene RT-PCR-Kontrolle durchgeführt, indem 4 µL resuspended Microsomen in 46 µL RT-PCR Master Mix verdünnt und die Reaktion parallel zur Emulsion RT-PCR thermocycelt wurden. PCR-Montage Produkte wurden extrahiert aus der emulsion mit isobutanol (2-Methyl-1-propanol, Sigma) und Zymo-DNA Clean & Konzentrator-5 kit (Zymo Research), wie zuvor veröffentlicht . Die resultierende DNA und das PCR-Produkt aus der offenen PCR-Kontrolle wurden auf ein 1,2% iges TBE-Agarose-Gel geladen und mit 90 V für 60 min abgetrennt., Montageprodukte der Größe 800-950 bp wurden aus dem Agarosegel größenwählt und die Produkte wurden mit einem Zymoclean Gel DNA Recovery Kit zurückgewonnen. Montageprodukte wurden in 6 mM Tris-Cl pH 8 eluiert und bis zur weiteren Analyse bei − 20 °C gelagert.,
Verschachtelte PCR-Amplifikation von Maus-hybridom-Montage Produkte
Nach der emulsion assembly Reaktion, die Montage-Produkte wurden verstärkt mit adapter-Primer TitA_fwd, 5′ CGT ATC GCC TCC CTC GCG CCA TCA G-3′, und TitB_rev, 5′ – CTA TGC GCC TTG CCA GCC CGC TCA G-3′, mit der Phusion high-fidelity DNA polymerase kit (Finnzymes) mit den folgenden thermocycling-Bedingungen: Anfängliche Denaturierung bei 98 °C für 30 s, dann 15 Zyklen von Denaturierung bei 98 °C für 7 s, annealing/extension bei 72 °C für 30 s, gefolgt von einer letzten Verlängerung Schritt bei 72 °C für 5 min., PCR-Produkte wurden gereinigt mit Zymo-DNA Clean & Konzentrator-5-kit. Die Paarung von HC und LC in den Montageprodukten wurde dann mittels PCR unter Verwendung von verschachtelten Primern analysiert, die spezifisch für die drei verschiedenen HC und drei verschiedenen LC sind (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S1e), wobei das Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Kit mit den folgenden Thermocycling-Bedingungen verwendet wurde: anfängliche Denaturierung bei 98 °C für 30 s, dann 24 Zyklen der Denaturierung bei 98 °C für 7 s und Glühen/Ausdehnung bei 72 °C für 30 s, gefolgt von einem endgültigen Verlängerungsschritt bei 72 °C für 5 min., Verschachtelte PCR-Produkte wurden auf ein 1,2% iges TBE-Agarose-Gel geladen und mit 90 V für 40 min abgetrennt. Die Echtzeit-verschachtelte PCR zur Quantifizierung der Kreuzkontamination wurde in dreifacher Ausführung mit denselben verschachtelten Primern unter Verwendung von SYBRGreen Master Mix (Applied Biosystems) auf einem StepOne qPCR Cycler (Applied Biosystems) unter folgenden Thermocyclingbedingungen durchgeführt: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen der Denaturierung bei 95 °C für 15 s, Glühen bei 56 °C für 30 s und Ausdehnung bei 72 °C für 45 s., Die anfänglichen Abundanzen der verstärkten Montageprodukte wurden nach der 2^(-deltaCt) – Methode berechnet und als Balkendiagramme mit Fehlerbalken dargestellt, die eine Standardabweichung vom Mittelwert zeigen.
Immunisierung und CD19+ B-Zellisolierung aus peripheren Vollblutproben
Die in dieser Studie verwendeten humanen peripheren Vollblutproben wurden von in erhalten.vent Diagnostica GmbH als Nebenprodukte aus routinemäßigen Diagnoseverfahren. in.,die vent Diagnostica GmbH hat eine schriftliche Einwilligung des Spenders zur Verwendung der Nebenprodukte für die Forschung erteilt und verfügt über eine ethische Genehmigung der Freiburger Ethikkommission International (FEKI-Code 011/1763) für die Verteilung von Proben. Ein gesunder Proband wurde einer Auffrischimmunisierung mit Tetanustoxoid (TT)/Diptherietoxoid (DT) unterzogen (Td-pur®; 20 Internationale Einheiten TT und 2 IE DT; Novartis, Basel, Schweiz)., Peripheres K2-EDTA-Vollblut aus der Präimmunisierung (Tag 0) und sieben Tage nach der Td-Booster-Immunisierung wurden zur Isolierung von CD19+ B-Zellen unter Verwendung des CD19 pluriHead Cell Separation Kit (pluriSelect GmbH, Leipzig, Deutschland) nach dem Herstellerprotokoll verwendet. Isolierte CD19+ B-Zellpellets wurden in 1 ml kaltem PBS gewaschen und bei 300 g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert Zellpellets, die 1,5 Millionen B – Zellen aus Prä-und Postimmunisierungsproben entsprachen, wurden bis zur Cycloheximidbehandlung und Mikrosomenpräparation auf Eis gehalten.,
Emulsion RT-PCR-Montage unter Verwendung von humanen B-Zell-Mikrosomen
Wir Hinzugefügt 2 µL der verdünnten Mikrosomen präpariert aus gefrorenen ARH-77-Zellen (als interne pairing control) 26 µL resuspendiert Mikrosomen von B-Zellen sowohl pre – und post-Td-Impfung, so dass die endgültige Bruch der ARH-77-Mikrosomen 0,5% (v/v). Wir verdünnten 16 µL dieser Mikrosomen suspension in 184 µL RT-PCR-master-mix enthält 1 x dART 1-step RT-PCR master buffer-mix (Roboklon), 2× dART master-Enzym-mix (Roboklon), 0.,5 µg / µL BSA, 100 µg / ml Cycloheximid und Primer für Reverse Transkription (IgM, IgG und IgK) und schwere (VH) und leichte Kette (VK) Montage. Primersequenzen und Konzentrationen im RT-PCR Master Mix sind in Zusatzdatei 1: Tabelle S2 aufgeführt., Die resultierenden 200 µL wässriger Lösung wurden verwendet, um eine Wasser-in-Öl-Emulsion durch tropfenweise Zugabe (13 Aliquots von 15 µL in 30 s-Intervallen) zu 800 µL Ölphase zu bilden, die aus 73% Emulsionskomponente 1, 7% Emulsionskomponente 2 und 20% Emulsionskomponente 3 des Mizellel-DNA-Emulsions-und Reinigungskits (Roboklon) während kontinuierlichen Rührens auf einem Magnetrührer besteht., Sechs Aliquots von jeweils 100 µL der resultierenden Emulsion wurden in PCR-Röhrchen überführt und unter folgenden Bedingungen Thermocycling unterzogen: Umgekehrte Transkription bei 55 °C für 30 min, anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 3 min, dann drei Denaturierungszyklen bei 95 °C für 20 s, Glühen bei 56 °C für 30 s und Ausdehnung bei 72 °C für 2 min, dann 20 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 20 s, Glühen bei 56 °C für 30 s und Ausdehnung bei 72 °C für 4 min, gefolgt von einer abschließenden Denaturierung bei verlängerungsschritt bei 72 °C für 5 min., PCR-Montage Produkte wurden extrahiert aus der emulsion mit isobutanol (2-Methyl-1-propanol, Sigma) und Zymo-DNA Clean & Konzentrator-5 kit (Zymo Research), wie zuvor veröffentlicht . Die resultierenden DNAs wurden auf ein 1% iges TBE-Agarosegel beladen und mit 100 V für 45 min abgetrennt. Montageprodukte von 700-800 bp wurden aus dem Agarosegel größenwählt, mit einem Zymoclean Gel DNA Recovery Kit gewonnen, in 6 mM Tris-Cl pH 8 eluiert und bei − 20 °C bis zur weiteren Analyse gelagert.,
Verschachtelte PCR-Amplifikation von Human-B-Zell-Montageprodukten
Zur spezifischen weiteren Amplifikation der HC-LC-Montageprodukte wurde eine verschachtelte PCR-Amplifikation mit verschachtelten Primern durchgeführt, die spezifisch für IgM -, IgG-und IGK-konstante Regionen sind (Zusätzliche Datei 1: Tabelle S2). Die PCR-Reaktion enthielt verschachtelte Primer in 0,4 µM-Konzentrationen, 200 µM dNTP-Mix, 1× Q5-Reaktionspuffer und 0,02 U/µL Q5-High-Fidelity-DNA-Polymerase (New England Biolabs) in einem Reaktionsvolumen von 50 µL mit 3 µL zusammengesetzter DNA., Die verschachtelte PCR-Amplifikation wurde unter folgenden Thermocycling-Bedingungen durchgeführt: anfängliche Denaturierung bei 98 °C für 3 min, dann 34 Denaturierungszyklen bei 98 °C für 30 s und Glühen/Ausdehnen bei 71 °C für 1 min, gefolgt von einem endgültigen Verlängerungsschritt bei 72 °C für 5 min. Die Proben wurden nach drei verschiedenen PCR-Zykluszahlen (28, 31 und 34 Zyklen) entnommen. Amplifizierte PCR-Produkte wurden auf 1% TBE-Agarose-Gele geladen und mit 100 V für 60 min abgetrennt., Die gewünschten Produkte von ~ 710 bp wurden wie oben beschrieben extrahiert, Sequenzierungsbibliotheken wurden nach dem Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Guide hergestellt und 2 × 250 Base Paired-End-Lesevorgänge wurden unter Verwendung der Illumina MiSeq-Plattform sequenziert.
Bioinformatische analyse von gepaarten antikörper schwere und leichte kette repertoires
Demultiplexing von 2 × 250 basis gepaart-end liest von die MiSeq sequencing plattform wurde durchgeführt basierend auf adapter indizes und sequenzierung daten wurden erhalten in fastq format., Nur Lesevorgänge mit minimalen Phred-Qualitätswerten von 10 über 50% aller Nukleotide wurden beibehalten und auf IgM -, IgG-und IgK-konstante Regionssequenzen gescannt. Lesepaare ohne konstante Bereichssequenzen oder mit HC-HC – oder LC-LC-Struktur wurden herausgefiltert und die verbleibenden Lesevorgänge wurden in das fastq-Format konvertiert und als Eingabe für die Analyse mit MiXCR (v1.2) zur Ausrichtung von Lesevorgängen auf Referenz-V(D)J-und C-Gensequenzen aus der IMGT-Datenbank , Extraktion und Clustering von CDR-H3-Nukleotid verwendet (zusätzliche Datei 1: Tabelle S1)., HC-CDR3-Sequenzen mit Frameshifts oder Stop-Codons und mit weniger als zwei Lesevorgängen wurden herausgefiltert. Wir haben eine HC-LC-Paarungsstatistikdatei erstellt, um die Verwendung von gepaarten VH-VK-Genen in den gesamten gepaarten HC-LC-Genrepertoires zu demonstrieren. Heatmaps wurden mit R generiert und mit ggplot2 grafisch dargestellt. Als nächstes wurden interindividuelle TT-spezifische HC-CDR3-Sequenzen identifiziert, indem HC-CDR3-Aminosäuresequenzen, die aus der Post-Td-Booster-Immunisierungsprobe erhalten wurden, mit zuvor gemeldeten TT-spezifischen HC-CDR3-Sequenzen verglichen wurden .,
PCR-Amplifikation von HC-und LC-Sequenzen in voller Länge
Wir haben eine zweistufige PCR-basierte Amplifikationsmethode (zusätzliche Datei 1: Abbildung S5) entwickelt, um Restriktionsverdauungsstellen in potenziell TT-spezifische HC-und LC-Sequenzen mit vollständiger V(D)J-Gensequenz einzubeziehen. Dies ermöglichte eine effiziente Klonierung von HC – und LC-Sequenzen in jeweilige Expressionsvektoren sowie die Produktion rekombinanter Antikörper für In vitro-Bindungsstudien., Kurz gesagt haben wir 14 gepaarte HC-LC-CDR3-Clonotypen ausgewählt, die aus der IgG-Sequenzierung nach der Td-Booster-Immunisierung erhalten wurden, basierend auf ihrer Frequenz, Paarungsgenauigkeit und dem Unterschied zwischen top1 LC-CDR3 und top2 LC-CDR3 gepaart mit der gegebenen HC-CDR3-Sequenz. Wir extrahierten die gesamte RNA aus gefrorenen B-Zellen, die aus der Post-Td-Booster-Immunisierung isoliert wurden, unter Verwendung der TRIzol-Reagenzreinigung (Ambion) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Im ersten Schritt wurde die RT-PCR – Amplifikation für jeden ausgewählten HC-und LC-CDR3-Clonotyp separat mit dem dART 1-step RT-PCR Kit (Roboklon) durchgeführt., Der RT-PCR-Mastermix (25 µL) enthielt HC-und LC-V-genspezifische Forward-Primer mit BssHII-Restriktionsstellenüberhängen zusammen mit einzelnen CDR3-spezifischen Reverse-Primern mit 18 Nukleotiden der FR4-Region bei 0,4 µM-Konzentrationen (zusätzliche Datei 1: Tabelle S3 und Abbildung S5), 1× dART-1-Schritt-RT-PCR-Master-Puffermix, 1× dART-Master-Enzymmix und 4,5 ng Gesamt-RNA., Die Thermocyclingbedingungen waren wie folgt: umgekehrte Transkription bei 55 °C für 30 min, anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 3 min, dann 23 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 20 s, Glühen bei 56 °C für 30 s und Ausdehnung bei 72 °C für 90 s, gefolgt von einem endgültigen Verlängerungsschritt bei 72 °C für 5 min. RT-PCR-Produkte wurden mit dem Agencourt AMPure XP – PCR-Reinigungskit (Beckman Coulter) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt und in 6 mM Tris-Cl pH 8.0 eluiert., Im zweiten Schritt wurden gereinigte RT-PCR-Produkte als Vorlage für die PCR-Amplifikation unter Verwendung von Q5-High-Fidelity-DNA-Polymerase (New England Biolabs) verwendet. Der verschachtelte PCR-Mastermix (50 µL) enthielt Forward-Primer, die eine BssHII-Restriktionsstelle codieren, und drei Nukleotide der HC-oder LC-Germline-Gensequenz zusammen mit Reverse-Primern, die den vollständigen FR4-Bereich und NheI/HindIII-Restriktionsüberhänge bei 0,4-µM-Konzentrationen enthalten (zusätzliche Datei 1: Tabelle S3 und Abbildung S5), 4 µL gereinigter DNA, 200 µM dNTP-Mix, 1× Q5-Reaktionspuffer und 0.,02 U/µL Q5 high-fidelity DNA-Polymerase (New England Biolabs). Die Thermocyclingbedingungen waren wie folgt: anfängliche Denaturierung bei 98 °C für 3 min, dann 16 Denaturierungszyklen bei 98 °C für 30 s, Glühen bei 69 °C für 30 s und Ausdehnung bei 72 °C für 1 min, gefolgt von einem endgültigen Verlängerungsschritt bei 72 °C für 5 min. PCR-Produkte wurden auf einem TBE-Agarose-Gel abgetrennt, HC-und LC − Amplikons in voller Länge mit Restriktionsverdauungsstellen wurden mit dem Zymoclean Gel DNA Recovery Kit (Zymo Research) aus dem Gel extrahiert und Produkte wurden bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert.,
Klonen und Expression rekombinanter monoklonaler Antikörper
Restriktionsverdauung von HC-und LC-Inserts in voller Länge und Expressionsvektoren (pCMV-CD30-4IE3_HC und pCMV-CD30-4IE3_LC) wurde mit den Restriktionsenzymen BssHII, NheI und HindIII (New England Biolabs) durchgeführt. Die resultierenden Produkte wurden auf 2% TBE-Agarose-Gele und Bänder von ~ 5,9 kb für das HC-Vektor-Backbone, 5,3 kb für das LC-Vektor-Backbone, ~ 370 bp für HC-Inserts und ~ 340 bp für LC-Inserts geladen Größe-ausgewählt auf Agarose-Gele und gereinigt, wie oben beschrieben., Ligationen der entsprechenden Inserts und Vektoren für die amplifizierten HC-und LC-Clonotypen wurden unter Verwendung der High-End-DNA-Ligase (New England Biolabs) durchgeführt und gemäß den Anweisungen des Herstellers in chemisch kompetente E. coli TOP10-Zellen (IBA) mit einem Schuss transformiert. Plasmid-DNAs wurden mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) aus transformierten Kolonien (8-16 Kolonien) isoliert; Ähnlichkeiten zu den Konsenssequenzen wurden durch Kapillarsanger-Sequenzierung bestätigt., HC-und LC-Plasmid-DNA-Sequenzen, die den Konsenssequenzen am nächsten kamen, wurden in humane embryonale Nierenzelllinien HEK 293 T (ATCC, CRL-11268)-Zellen co-transfektiert. HEK 293 T-Zellen wurden unter Verwendung von Rich Glucose (4,5 g/L D-Glucose) Dulbeccos modifiziertem Eagle ‚ s Medium (Gibco BRL) kultiviert, ergänzt mit hitzeinaktiviertem ultra-low IgG fetalem Rinderserum (Thermo Fisher Scientific), 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin. Gereinigte Plasmid-DNAs für gepaarte HC – und LC-Klonotypen wurden unter Verwendung von PEI (Polyethylenamin, Polysciences) in 85-95% konfluente HEK 293 T-Zellen co-transfektiert., Kulturüberstände wurden vier Tage nach der Transfektion gesammelt und TT-Antigen-spezifische Clonotypen wurden durch indirekten ELISA identifiziert.
Enzyme-linked immunosorbent Assays (ELISA)
Wir führten indirekte ELISA-Assays durch, um mAbs zu identifizieren, die aus der immunisierten Probandbindung an TT-Antigen unter Verwendung der transfizierten Zellkulturüberstände stammen. Nunc-Immuno MicroWell 96-well solid plates (Thermo Fisher Scientific) beschichtet wurden mit 100 µL 10 µg/mL TT antigen (Statens Serum Institut, Kopenhagen, Dänemark) in 50-mM-Carbonat-Puffer, pH 9.,6, über Nacht bei 4 °C inkubiert, dreimal mit PBS gewaschen und mit 2% fettfreier Trockenmilch (Bio-Rad) in PBS für 150 min bei Raumtemperatur blockiert. Nach der Blockierung wurden 120 µL von 1: 2 seriell verdünnten transfektierten Überständen in PTM (PBS, 0,1% Tween-20, 2% fettfreie Trockenmilch) zu den Vertiefungen gegeben, 350 ng Maus-Anti-TT-mAb (GeneTex) wurden auf eine Well als positive Kontrolle angewendet, und Platten wurden für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit PBS-T (0.,1% Tween-20) und 50 µL einer 1:2000-Verdünnung von Ziegen-Anti-Human-Kappa-LC-HRP-Sekundärantikörper (Thermo Fisher Scientific) wurden in die Vertiefungen gegeben, 50 µL einer 1:2000-Verdünnung von Ziegen-Anti-Maus-IgG-HC-HRP-Sekundärantikörper (Sigma #A0168) wurden in den Positivkontrollbrunnen gegeben, Platten wurden für 2 min bei Raumtemperatur inkubiert und dreimal mit PBS-T. Für die Farbentwicklung fügten wir 50 µL einstufiges Ultra-TMB-ELISA-Substrat (Thermo Fisher Scientific) pro Vertiefung hinzu, inkubiert die Platten für 5 min bei Raumtemperatur, und stoppte die Ag:Ab Bindungsreaktion durch Zugabe von 50 µL 2 M H2SO4., Die Extinktion gemessen wurde bei 450 nm mit dem GloMax-Multi Detection System (Promega). ELISA-Assays für alle Clonotypen wurden in Triplikaten durchgeführt, die Werte wurden normalisiert, um Hintergrundsignale zu entfernen, und Fehler wurden als Standardabweichungen vom Mittelwert dargestellt.
Analyse der chimären Ampliconbildung während der verschachtelten PCR
Vier definierte HC-LC-Amplikons wurden durch Amplifikation der HC und LC aus den jeweiligen pCMV-Plasmiden (siehe oben) und unter Verwendung einer PCR-Assemblerreaktion zur Erzeugung der vier unterschiedlichen HC-LC-Assemblys erzeugt., HC-und LC-Plasmid-DNAs wurden als Vorlagen für die PCR-Amplifikation der klonalen Kettenpaare Top1, Top2, Top3 und Top4 unter Verwendung von Primern verwendet, die für die jeweiligen VH-und VK-Genfamilien sowie IgG-und IgK-konstanten Regionen spezifisch sind (zusätzliche Datei 1: Tabelle S2 und Abbildung S6a). Gereinigte plasmid-DNA (10 ng) wurde Hinzugefügt, um jeweils 25 µL PCR-Reaktion mit 0,4 µM von jedem primer, 200 µM dNTP-mix, 1 x Q5 Reaktion Puffer und 0,2 U/µL Q5 high-fidelity DNA-Polymerase., Der thermische Zyklus wurde mit anfänglicher Denaturierung bei 98 °C für 3 min durchgeführt, gefolgt von 25 Denaturierungszyklen bei 98 °C für 30 s, Glühen/Ausdehnen bei 71 °C für 1 min (für HC-Plasmid-DNA) oder Glühen bei 64 °C für 1 min und Ausdehnen bei 72 °C für 1 min (für LC-Plasmid-DNA), gefolgt von einem endgültigen Verlängerungsschritt bei 72 °C für 5 min. PCR-Produkte wurden auf separate 1% ige TBE-Agarose-Gele geladen und mit 100 V für 60 min abgetrennt. Die gewünschten DNA-Produkte von ~ 400 bp (für HC) und ~ 350 bp (für LC) wurden wie oben beschrieben größenausgewählt und aus dem Gel extrahiert., Die gereinigten HC-und LC-PCR-Produkte wurden als Vorlagen für die HC – und LC-Montage durch Überlappungserweiterung PCR verwendet (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S6b). Kurz gesagt wurden 5 ng jeder HC und entsprechende gepaarte LC-DNA in jede 50 µL PCR-Reaktion gegeben, die 1× dART-1-Schritt-RT-PCR-Masterpuffer (Roboklon), 2× dART-Master-Enzym (Roboklon) und 0,4 µM jedes IgG-und IgK-Konstantbereichsprimers enthielt (zusätzliche Datei 1: Tabelle S2)., Der thermische Zyklus wurde mit RT-Inaktivierung bei 95 °C für 3 min durchgeführt, gefolgt von drei Zyklen der Denaturierung bei 95 °C für 20 s, Glühen bei 56 °C für 30 s und Ausdehnung bei 72 °C für 2 min, gefolgt von 25 Zyklen der Denaturierung bei 95 °C für 20 s, Glühen bei 56 °C für 30 s und Ausdehnung bei 72 °C für 4 min, gefolgt von einem letzten Verlängerungsschritt bei 72 °C für 5 min. Die Montageprodukte wurden auf 1% TBE-Agarose-Gele geladen und 45 min mit 100 V abgetrennt. Die Montageprodukte von ~ 750 bp wurden wie oben beschrieben größenausgewählt und aus dem Agarosegel extrahiert., Die einzeln zusammengesetzten Klonpaare HC-LC wurden zusammengefügt und als Vorlage für die verschachtelte PCR-Amplifikation mit für IgG-und IgK-konstante Regionen spezifischen Primern verwendet (Zusätzliche Datei 1: Tabelle S2, Abbildung S6c). Die verschachtelten PCR-Reaktionsbedingungen und die thermischen Zyklusbedingungen waren die gleichen wie im Abschnitt „Verschachtelte PCR-Amplifikation menschlicher B-Zell-Montageprodukte“ beschrieben, mit der Ausnahme, dass die PCR-Amplifikation für 25 Zyklen durchgeführt wurde. PCR-Produkte wurden auf 1% TBE-Agarose-Gele geladen, mit 100 V für 60 min abgetrennt und gewünschte Produkte von ~ 720 bp extrahiert, wie oben beschrieben., Sequenzierungsbibliotheken aus den einzelnen Assemblys und aus den gemischten Assemblys nach der verschachtelten PCR wurden nach dem Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Guide vorbereitet und 2 × 250 Base Paired-End Reads wurden mit der Illumina MiSeq Plattform erzeugt.