detección de Pneumocystis jiroveci en muestras respiratorias mediante cuatro métodos de tinción

Pneumocystis jiroveci, anteriormente conocido como Pneumocystis carinii, sigue siendo una causa importante de neumonía en pacientes inmunocomprometidos, aunque las infecciones con este agente han disminuido después del uso generalizado de la terapia antirretroviral de alta actividad (TARGA) para la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (9, 12). Los pacientes inmunocomprometidos por razones distintas a la infección por el VIH también están en riesgo de neumonía causada por P., jiroveci, incluyendo pacientes con neoplasias hematológicas y aquellos que han recibido agentes inmunosupresores para el tratamiento de enfermedades autoinmunes (2, 11, 12).

aunque se han desarrollado una variedad de ensayos de amplificación de ácido nucleico, incluyendo ensayos de PCR en tiempo real, para la detección de P. jiroveci, estos ensayos no son comunes en la mayoría de los laboratorios de microbiología clínica y no están disponibles comercialmente (3, 5). Por lo tanto, el principal método de laboratorio para la detección de P., jiroveci, un organismo que no puede ser cultivado por métodos estándar, es el examen visual directo de la muestra clínica después de algún tipo de método de tinción (12). Se ha utilizado una variedad de tinciones histoquímicas para detectar Pneumocystis en muestras clínicas. Estas manchas histoquímicas incluyen las manchas Diff-Quik, Grocott-Gomori methenamine silver (GMS) y Calcofluor white. La tinción Diff-Quik es una modificación de la tinción Wright (3). La tinción GMS es una tinción de precipitación de plata comúnmente utilizada para visualizar hongos en secciones histológicas (10)., La tinción blanca de Calcofluor es una tinción fluorescente, cuyo ingrediente activo es cellufluor, que se une No específicamente a los polisacáridos ligados a beta, como la quitina y la celulosa, y se utiliza para la visualización directa de hongos en muestras clínicas (4). Las tinciones inmunofluorescentes, que emplean anticuerpos dirigidos contra P. jiroveci, también están disponibles para la detección directa de este organismo en muestras clínicas (3, 5). Estas manchas son similares a las manchas inmunofluorescentes directas e indirectas utilizadas para la detección de virus en muestras clínicas., Cada mancha tiene sus proponentes; los datos comparativos en la era TARGA son limitados.

Por lo tanto, se realizó una evaluación multiinstitucional de cuatro métodos de tinción comúnmente utilizados para la detección directa de P. jiroveci en muestras clínicas respiratorias. Los portaobjetos de muestras respiratorias estudiadas, la mayoría de las cuales eran muestras de lavado broncoalveolar, se prepararon mediante citocentrifugación. Se examinaron frotis replicados de 313 muestras respiratorias presentadas para el examen de P. jiroveci en busca de la presencia de P. jiroveci con el Calcofluor blanco (Fungifluor; Polysciences, Inc.,, Warington, Pa.), GMS, Diff-Quik (Baxter Scientific, McGraw Park, Ill.), y Merifluor Pneumocystis (Meridian Bioscience, Inc., Cincinnati, Ohio) stains. Los portaobjetos fueron teñidos con las tinciones Merifluor Pneumocystis y Diff-Quik según las instrucciones del fabricante. Para la tinción de Calcofluor blanco, se agregó 1 gota de Fungifluor a cada portaobjetos, se aplicó el cubreobjetos de manera que el reactivo cubriera toda el área que contiene la muestra, y se permitió que el portaobjetos permaneciera durante al menos 10 minutos en una cámara de humedad oscura a temperatura ambiente antes de la interpretación con un microscopio de fluorescencia., Para la tinción de GMS, los portaobjetos fueron microondas durante 40 s en una solución de ácido crómico al 10%, lavados con agua, y luego aclarados con metabisulfito de sodio al 1% durante 30 s. Después de lavar los portaobjetos con agua destilada, se colocaron en un frasco Coplin conteniendo 50.0 ml de solución de trabajo de metenamina y microondas durante otros 65 S., Los portaobjetos se enjuagaron nuevamente con agua destilada, se trataron con cloruro de oro al 1% durante 2 a 5 s, se enjuagaron con agua destilada, se expusieron a tiosulfato de sodio al 5% durante 1 min, se colorearon con una solución de trabajo de color verde claro, se aclararon en xileno, se cubrieron con láminas de cubierta y se examinaron mediante microscopía óptica de rutina.

Cada uno de los laboratorios de las cuatro instituciones participantes realizó una de las diferentes tinciones y realizó sus interpretaciones basadas en ese método de tinción., Los individuos de cada institución tenían experiencia con el método de tinción realizado allí y la interpretación de la tinción. Las muestras recibieron códigos de identificación únicos, y cada tinción se examinó de forma independiente, sin conocimiento del resultado obtenido por otro método de tinción en el mismo espécimen., La cantidad de espécimen rara vez fue insuficiente para hacer los cuatro portaobjetos; 308 portaobjetos estaban disponibles para la tinción con Calcofluor white, 310 portaobjetos estaban disponibles para la tinción con Merifluor Pneumocystis, 307 portaobjetos estaban disponibles para la tinción con Diff-Quik y 310 portaobjetos estaban disponibles para la tinción con GMS. En ninguno de los casos en que una diapositiva no estaba disponible debido a una cantidad insuficiente de espécimen, la categorización de esa muestra como un verdadero positivo o verdadero negativo (ver más abajo) dependió del resultado de la diapositiva ausente.,

la sensibilidad, la especificidad y los valores predictivos positivos y negativos se calcularon por métodos estándar (tabla 1). Las proporciones de resultados verdaderos positivos y falsos positivos para las pruebas pareadas se compararon con la prueba de chi-cuadrado utilizando el software estadístico EpiCalc 2000 (www.brixtonhealth.com/epicalc.html

aunque la tinción Merifluor Pneumocystis detectó más muestras positivas verdaderas, este número no fue significativamente diferente de los detectados por las tinciones Calcofluor white (P = 0.260) y GMS (P = 0.343)., Del mismo modo, el número de positivos verdaderos detectados por GMS y las manchas blancas de Calcofluor no fueron significativamente diferentes (P = 0.838) entre sí. Sin embargo, el número de positivos verdaderos detectados por la tinción de Diff-Quik fue significativamente menor que los detectados por las tinciones de Merifluor Pneumocystis (P = 0,002), GMS (P = 0,027) y Calcofluor white (P = 0,042). El número de falsos positivos no fue significativamente diferente entre las tinciones Calcofluor white, GMS y Diff-Quik (cada comparación tuvo un valor de P de >0.05)., Sin embargo, el número de falsos positivos notificados después de la tinción con Merifluor Pneumocystis fue significativamente mayor que los notificados después de la tinción con GMS (P = 0,004), Calcofluor white (P = 0,001) o Diff-Quik (P = 0,001).

en algunos casos, una muestra de esputo inducido puede ser la primera muestra recibida para la evaluación de la presencia de Pneumocystis en el estudio diagnóstico de un paciente con neumonía sospechada de ser causada por este organismo (6)., Si una muestra de esputo inducida no produce el agente etiológico de la neumonía, entonces una muestra de lavado broncoalveolar, que es significativamente más costosa y conlleva un pequeño riesgo para el paciente, puede ser necesaria para obtener material diagnóstico., Debido a las diferencias en el tratamiento de la neumonía causada por Pneumocystis versus neumonía causada por otros microorganismos y la posible necesidad de broncoscopia, que conlleva un costo y riesgo adicional para el paciente, en caso de que no se establezca un diagnóstico, es importante que se utilice el mejor método de tinción posible para la detección de este organismo.,

Además, la importancia de un método de tinción sensible y específico en la era de la Targa es particularmente importante, ya que la menor prevalencia de neumonía causada por Pneumocystis afecta negativamente el valor predictivo positivo de cualquier ensayo que tenga una especificidad inferior al 100% (9). Aunque la prevalencia de neumonía causada por Pneumocystis es diferente en la era TARGA que en la era pre-TARGA, la elección del método de tinción óptimo para la detección de Pneumocystis también es importante para los pacientes con otras condiciones inmunocomprometentes que están en riesgo de infección., De hecho, la elección del método de tinción óptimo puede ser más importante para la detección de Pneumocystis en los pacientes inmunocomprometidos no infectados por el VIH, ya que se ha demostrado que las muestras respiratorias de estos pacientes tienen una carga de organismos menor que las de los pacientes inmunocomprometidos infectados por el VIH (6).

en nuestra experiencia, la tinción de Diff-Quik no fue un medio eficaz de detección de la presencia de P. jiroveci (es decir, un método de tinción primaria) debido a la baja sensibilidad y el valor predictivo negativo de esta tinción. Significativamente más especímenes que contenían P., los jiroveci se perdieron por el método Diff-Quik que con Calcofluor white, Merifluor Pneumocystis y GMS. Raab et al. describir también una baja sensibilidad (68%) y una baja especificidad (88%) cuando se utilizó la tinción de Diff-Quik sola para la detección de Pneumocystis y otros hongos en muestras de lavado broncoalveolar (10). Estos hallazgos, sin embargo, están en contraste con los de otros grupos, que han informado que el método Diff-Quik fue comparable al método de tinción GMS para la detección de Pneumocystis (7, 8)., Un grupo informó que el método Diff-Quik era más sensible que el blanco Calcofluor, la tinción inmunofluorescente directa e incluso la PCR, pero estos resultados no han sido corroborados (1).

Por el contrario, la tinción Merifluor Pneumocystis fue el método de tinción más sensible y puede resultar útil como pantalla para descartar la presencia de Pneumocystis, pero fue el método menos específico en este estudio. Sin embargo, el número de resultados falsos positivos con la tinción de Merifluor Pneumocystis fue significativamente mayor que el reportado para cada una de las otras tinciones., La tinción de Merifluor Pneumocystis tuvo un valor predictivo positivo de solo 81,9%, en comparación con los otros tres métodos, todos los cuales tuvieron valores predictivos positivos superiores al 96%. Ng et al. también han descrito resultados falsos positivos aparentes con este método de tinción (8). Por lo tanto, sugerimos que si se utiliza Merifluor Pneumocystis como método de tinción primaria en un laboratorio de Microbiología Clínica, entonces se debe realizar la confirmación con un segundo método para aumentar la especificidad y el valor predictivo positivo del resultado final de la prueba.,

las sensibilidades de las tinciones Calcofluor white y GMS fueron intermedias entre las de Diff-Quik y Merifluor Pneumocystis, pero fueron altamente específicas y tuvieron valores predictivos positivos por encima del 96% y valores predictivos negativos por encima del 93%. Fraire et al. también han descrito las tinciones Calcofluor white y GMS como comparables para la detección de Pneumocystis, con una concordancia del 92,6% (4). Baughman et al., (1a) también describen la sensibilidad de una tinción de anticuerpo inmunofluorescente indirecta que está dirigida hacia Pneumocystis y es superior en sensibilidad en comparación con una tinción de Wright modificada y una tinción de GMS, pero informaron sobre un único resultado falso positivo y, por lo tanto, una especificidad mucho mayor de lo que describimos. Es posible que con la práctica adicional, uno podría reconocer más fácilmente las formas patognomónicas con la tinción de Diff-Quik, elevando así la sensibilidad de ese ensayo., Del mismo modo, tal vez con experiencia adicional con la tinción de Merifluor Pneumocystis, uno podría aprender a discriminar mejor entre tinción de verdadero positivo y falso positivo y, por lo tanto, disminuir el número de resultados falsos positivos.

en nuestra experiencia, Los tintes Calcofluor white y GMS tienen los mejores parámetros para el uso rutinario en un laboratorio clínico. Aunque estos ensayos eran menos sensibles que el ensayo inmunofluorescente, eran altamente específicos y tenían valores predictivos positivos y negativos más que aceptables.,

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