PCR es la técnica de los modernos laboratorios de biología molecular. Si necesita copiar, secuenciar o cuantificar el ADN, necesita saber la PCR. En resumen, la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) es una técnica bioquímica que utiliza termociclado y enzimas para copiar ADN de manera rápida y confiable, y fue inventada en un instante de inspiración por un científico que conducía por la carretera 128 de San Francisco a Mendocino.,
Este artículo ofrece una breve descripción básica de la PCR, con algunos consejos para ayudarlo a evitar las trampas más comunes. Si eres nuevo, o relativamente nuevo en PCR, entonces esto es para ti. (E incluso si tiene experiencia en PCR, vale la pena una lectura para refrescarse, ¡y tal vez tome una o dos propinas!).
ingredientes básicos de PCR:
polimerasa
las polimerasas son enzimas que, en las condiciones adecuadas, pueden ensamblar nuevas hebras de ADN a partir de ADN plantilla y nucleótidos. La reacción original de PCR era engorrosa porque las altas temperaturas necesarias para desnaturalizar el ADN matarían a las polimerasas., Esto significaba que después de cada ciclo de calentamiento, nuevas polimerasas debían agregarse manualmente a la reacción, un esfuerzo costoso. Sin embargo, en la PCR moderna esto no es un problema, ya que las polimerasas utilizadas en la PCR moderna generalmente provienen de una de las dos fuentes de bacterias termofílicas, Thermus aquaticus o Pyrococcus furiosus. Estas polimerasas, respectivamente, Taq (pronunciado «tack») y Pfu (pronunciado» P-F-U») soportan fácilmente las altas temperaturas asociadas con una reacción de PCR., Las polimerasas comerciales de Taq y Pfu están diseñadas para la velocidad, la fidelidad, la processividad (capacidad de completar lecturas largas) y su capacidad de leer plantillas ricas en GC. Las empresas están constantemente saliendo con nuevas polimerasas. Por lo tanto, no se conforme con «lo que esté en su congelador», sino busque la mejor polimerasa comercial para sus necesidades de PCR. También hable con su representante de ventas local, ya que a menudo pueden entregar muestras gratuitas de polimerasa, para que pueda decidir qué es lo mejor para usted.
plantilla de ADN
Este es el ADN para el que diseñas tus cebadores., Es el ADN que su polimerasa leerá y copiará. Su ADN de plantilla puede ser genómico, plásmido o cDNA, pero sea cual sea la calidad de su fuente cuenta. Cuanto más intacto y puro sea su ADN de plantilla, más fácil será obtener buenos resultados de PCR. También tenga en cuenta que la cantidad ideal de ADN dependerá de su fuente, generalmente 1 pg-1 ng de ADN plásmido o 1 ng – 1 µg de ADN genómico por reacción de PCR.
cebadores
los cebadores son fragmentos cortos de ADN sintetizado que se unen a su ADN de plantilla. Tendrá que diseñar una imprimación «hacia adelante» y una imprimación «inversa»., Su imprimación delantera designa el inicio de su PCR. La secuencia de esta cartilla es la misma que la secuencia de ADN de la plantilla 5-3. Su imprimación inversa designa el final de su PCR. La secuencia de esta cartilla es el complemento inverso de su ADN de plantilla. En general, los cebadores tienen entre 18 y 22 pares de bases. Sin embargo, más importante que su longitud es la temperatura de fusión de sus cebadores. La temperatura de fusión de sus cebadores debe ser de 54-60°C y lo más similar posible entre sí., Hay muchas calculadoras en línea que pueden calcular las temperaturas de recocido de imprimación, y la mayoría de las compañías que sintetizan imprimaciones suministran tales calculadoras.
nucleótidos
como monómeros del ADN, los nucleótidos son necesarios para hacer copias de ADN. Para la mayoría de los PCR de ADN, usará trifosfatos de Desoxinucleósidos (dNTPs). Puede comprarlos por separado o como una mezcla de dGTP, dCTP, dATP y dttp. Sin embargo, independientemente de lo que compre, tenga en cuenta que los nucleótidos son muy sensibles a los ciclos de congelación/descongelación. Por lo tanto, es mejor crear siempre pequeñas alícuotas de sus dNTPs., También asegúrese de almacenarlos correctamente: no use un congelador sin heladas que pase por ciclos automáticos de descongelación.
Buffer
La mayoría de las polimerasas comerciales vienen con su buffer ideal. Estos tampones no solo suministran el pH correcto, sino que siempre tienen aditivos como magnesio, potasio o DMSO, que ayudan a optimizar la desnaturalización del ADN, la renaturalización y la actividad de la polimerasa. Habrá más sobre estos aditivos en un próximo artículo.
Termociclado:
aquí es donde sucede la magia., Todos los ingredientes anteriores se agregan a un tubo de PCR y el tubo es termociclado. Con el fin de lograr el termociclado cuando la PCR se inventó por primera vez, los tubos de PCR individuales se movieron manualmente entre baños de agua calentados. (Y usted piensa que su trabajo de banco es tedioso! Ahora, gracias a la invención de «Mr. Cycles», la primera máquina de termociclado, la regulación de la temperatura ahora se realiza automáticamente por termocicladores. El siguiente es un perfil típico de termociclador PCR:
inicialización
en este paso, la reacción se calienta a 94-96°C durante 30 segundos a varios minutos., Este paso generalmente solo se realiza una vez al comienzo de su reacción de PCR. Este paso es importante para activar las polimerasas de arranque en caliente, si se utiliza una polimerasa de este tipo, y para desnaturalizar su ADN plantilla. Tenga en cuenta que si el contenido de GC de su plantilla es alto, es posible que deba realizar un paso de inicialización extra largo.
desnaturalización (repetida 15-40 veces)
en este paso, la reacción se calienta a 94-98°C durante 15-30 segundos. Este paso desnaturaliza su ADN y cebadores, lo que les permitirá recocirse entre sí en el siguiente paso.,
recocido (repetido 15-40 veces)
en este paso, la temperatura de su reacción se reduce rápidamente a 50-64°C durante 20-40 segundos. La temperatura en este paso debe ser lo suficientemente baja como para que sus cebadores desnaturalizados puedan formar pares de bases Watson-Crick con su ADN de plantilla. Pero lo suficientemente alto como para que solo las estructuras de ADN de doble cadena más estables (perfectamente emparejadas) puedan formarse. Por lo general, esta temperatura de recocido perfecta es unos pocos grados más baja que la temperatura de fusión de su par de imprimación. También durante este paso, su polimerasa se unirá a su complejo de ADN de imprimación/plantilla., Aunque su polimerasa no comenzará a leer hasta que la temperatura se eleve en el siguiente paso.
alargamiento o extensión (repetido 15-40 veces)
en este paso, su reacción se calienta rápidamente a 72-80°C. Aquí es cuando su polimerasa comenzará a leer (en la dirección 5-3) y a copiar su ADN de plantilla (en la dirección 3-5). La temperatura más alta durante este paso reduce las interacciones No específicas del primer / plantilla de ADN, aumentando así la especificidad de su reacción., Sin embargo, la temperatura exacta será determinada por la preferencia de su polimerasa, así que lea su embalaje. La duración de este paso depende de cuánto tiempo será su copia de ADN. Típicamente, la ADN polimerasa puede copiar 1.000 pares de bases por minuto. Por lo tanto, debe permitir al menos 1 minuto de tiempo de extensión por 1,000 bases. Al final de esta incubación se habrán creado nuevas piezas de ADN de doble cadena, que consisten tanto en la plantilla como en el nuevo ADN.
Paso 2-4 se repite 15-40 veces
es cierto que la más ciclos de programar el más copias de ADN va a crear., Sin embargo, hay un límite superior. En algún momento los nucleótidos libres disponibles se vuelven limitantes y las copias de ADN truncadas prematuramente pueden convertirse en un problema. Así que no te vuelvas codicioso con tu ciclismo. Menos pero un buen producto de PCR limpio es preferible a un montón de producto sucio.
alargamiento Final
Este es un paso opcional pero a menudo recomendado. En este paso, la reacción se mantiene a 70-74°C durante varios minutos. (Por lo general, utilizará la misma temperatura que utilizó en el paso de alargamiento o extensión.) Este paso permite que las polimerasas terminen de leer cualquier hebra en la que se encuentren actualmente., Este paso opcional puede ayudar a reducir el número de copias truncadas en su producto final.
retención Final
Su reacción ahora está completa. Dado que todo el proceso puede tomar algunas horas, Las reacciones de PCR a menudo se realizan durante la noche o cuando se ha alejado; se recomienda que programe su termociclador para mantener su producto de PCR a 4°C hasta que regrese. En ese momento puede analizar o usar su producto, o transferirlo a un almacenamiento más adecuado a largo plazo, como su refrigerador.
buena suerte y feliz PCR-ing!
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