líneas celulares
la línea celular HEK 293T se obtuvo de la colección de cultivos de tipo americano (ATCC CRL-3216). Las líneas celulares de hibridoma de ratón KT13 y KT22 se obtuvieron de los estudios de desarrollo Hybridoma Bank (Dshb). Ambas líneas celulares fueron depositadas en el DSHB por Kazumasa Takeda y Asako Sugimoto (dshb hybridoma products KT13 y KT22)., La línea celular de hibridoma de ratón 5E4 / 1F1 fue proporcionada amablemente por Miha Kosmač y Vladka Čurin Šerbec (Universidad de Ljubljana). Se cultivaron células HEK 293T e hibridomas en DMEM (Gibco) suplementadas con 13% de FBS (Gibco), 1× penicilina/estreptomicina (Thermo Fisher) y 1× GlutaMAX (Gibco). Las secuencias de anticuerpos HC y LC de hibridomas individuales se determinaron mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) y secuenciación capilar (Eurofins Genomics).,
tratamiento con Cicloheximida y preparación de microsomas
todos los pasos de pipeteo se realizaron en hielo y las centrifugaciones se realizaron a 4 °C utilizando una centrífuga Eppendorf 5810R con rotor de ángulo fijo F-45-30-11. Se utilizaron Tubos centrífugos Protein LoBind de 1,5 mL (Eppendorf) para minimizar la adhesión celular a las paredes del tubo. Células HEK 293T (1 millón), células de hibridoma de ratón (1 millón de células 5E4, KT13 y kt22 mezcladas en proporción 1:1:1), células leucémicas ARH-77 (ATCC CRL-1621, 1 millón) o células CD19+ B humanas recién aisladas de muestras de vacunación de refuerzo previa y posterior a la vacuna Td (1.,5 millones cada uno) se resuspendieron en 1 mL de PBS con 50 µg/mL de cicloheximida y se incubaron durante 10 min para detener los ribosomas con ARN mensajeros asociados (ARNm) en el retículo endoplasmático áspero. Las células se peletizaron con 300 g durante 10 min a 4 °C y se resuspendieron mediante pipeteo de 15× hacia arriba y hacia abajo en 120 µL de tampón de lisis de alta densidad (25 mM HEPES-KOH pH 7,2, 110 mM acetato de potasio, 5 mM acetato de magnesio, 1 mM EGTA, 25% sacarosa , 5% glicerol, 1 mM 1,4-ditiotreitol, 1× cóctel completo de inhibidores de la proteasa libre de EDTA , 0,1 mg/mL cicloheximida, 0,015% de digitonina y 400 U/ml de inhibidor de ribolock RNasa )., La lisis de células y orgánulos se completó mediante incubación durante 10 min en hielo. Cada homogeneizado se dividió en dos alícuotas de 55 µL y se transfirió a dos tubos lobindos de proteína fresca. Los tubos se centrifugaron a 600 g durante 3 minutos a 4 ° C para pelletear núcleos y desechos celulares. Un total de 40 µL sobrenadante de cada tubo, que contenía fracciones de membrana y citosol, se transfirieron a tubos lobind de proteínas frescas y la concentración de sacarosa se diluyó a 0,37–0,40 M (12-13% p/p) mediante la adición de 40 µL de agua libre de nucleasas. Los microsomas fueron sedimentados por centrifugación con 20.800 g durante 120 min a 4 °C., Los sobrenadantes que contenían citosol se desecharon y los gránulos de membrana se resuspendieron mediante pipeteo de 10× hacia arriba y hacia abajo en un tampón de lavado de 85 µL (25 mM HEPES-KOH pH 7,2, 110 mM acetato de potasio, 2,5 mM acetato de magnesio, 1 mM EGTA, 1 mM 1,4-ditiotreitol, 1× cóctel completo de inhibidores de la proteasa sin EDTA, 0,1 mg/mL cicloheximida, 0,004% de digitonina y 400 U/ml RiboLock inhibidor de la RNasa). Los microsomas fueron sedimentados nuevamente por centrifugación con 20.800 g durante 60 min a 4 °C., Los sobrenadantes se desecharon y los gránulos del microsoma se resuspendieron en 20 µL de tampón de lavado y se mantuvieron en hielo hasta su uso posterior.
Microscopía Electrónica de transmisión
se aplicaron alícuotas de muestra de 3,5 µL de microsomas HEK 293t resuspendidos a las rejillas Quantifoil (Quantifoil, Alemania) recién descargadas con resplandor, cubiertas con una película adicional de soporte de carbono de 2 nm y congeladas flash en etano líquido utilizando un émbolo Vitrobot (Fei). Las muestras se tomaron en un microscopio electrónico de transmisión de espíritu Tecnai (Fei) operado a 120 kV equipado con una cámara CCD Eagle (FEI) de 2 × 2 K., Se registraron micrografías en condiciones criogénicas de dosis baja con un aumento nominal de 42.000× (tamaño de píxel a escala de objeto: 5,2 Å/px) aplicando un desenfoque de − 2 a − 4 µm. La recolección de datos se realizó de forma manual o totalmente automática utilizando Leginon .
emulsión RT-PCR conjunto utilizando microsomas de hibridoma de ratón
diluimos 16 µL de microsomas resuspendidos de hibridomas mixtos 5E4, KT13 y KT22 en 184 µL RT-PCR master mix conteniendo 1× Verso 1-Step RT-PCR master mix (Thermo Scientific), 1× Verso enzyme mix (Thermo Scientific), 0.,5 µg/µL de ASC, 100 µg/mL de cicloheximida y cebadores para transcripción inversa y ensamblaje de HC y LC (0,8 µM cada uno de los cebadores TitA_MID1_IgM_rev y TitB_MID12_IgK_rev; 0,16 µM cada uno de los cebadores Oe_mhv_fwd y Oe_mkv_fwd). Las secuencias de imprimación se muestran en el archivo adicional 1: Figura S1a. los 200 µL de solución acuosa resultantes se utilizaron para formar una emulsión de agua en aceite por adición gota a gota (13 alícuotas de 15 µL en intervalos de 30 s) a una fase de aceite de 800 µL según Ge et al. (Aceite Mineral, Sigma M5904, con 4.5% Span 80, Sigma S6760, 0.4% Tween 80, Sigma P8074 y 0.,05% Triton X-100, Sigma T8787) durante la agitación continua en un agitador magnético., Seis alícuotas de 100 µL cada una de la emulsión resultante se transfirieron a tubos de PCR y se sometieron a termociclado con las siguientes condiciones: transcripción inversa a 50 °C durante 15 min, inactivación de Rtasa a 95 °C durante 2 min, luego cuatro ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 20 s, rampa de recocido de 60 °C a 50 °C durante 50 s y extensión A 72 °C durante 1 min, luego 16 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 20 s, recocido a 60 °C durante 30 s y extensión A 72 °C durante 1 min, seguida de una extensión final a 72 °C durante 5 min., En paralelo, se realizó un control Abierto de RT-PCR diluyendo 4 µL de microsomas resuspendidos en 46 µL de RT-PCR master mix y termociclando la reacción en paralelo con la emulsión RT-PCR. Los productos de ensamblaje de PCR se extrajeron de la emulsión utilizando isobutanol (2-metil-1-propanol, Sigma) y el kit concentrador-5 de Zymo DNA Clean & (Zymo Research) como se publicó anteriormente . El ADN resultante y el producto de PCR del control de PCR abierto se cargaron en un gel de agarosa TBE al 1,2% y se separaron con 90 V durante 60 min., Los productos de ensamblaje de 800-950 bp se seleccionaron del gel de agarosa y los productos se recuperaron utilizando un kit de recuperación de ADN de Zymoclean Gel. Los productos de montaje se elutaron en 6 mM Tris-Cl pH 8 y se almacenaron a − 20 °C hasta su posterior análisis.,
amplificación de PCR anidada de productos de ensamblaje de hibridoma de ratón
después de la reacción de ensamblaje de emulsión, los productos de ensamblaje se amplificaron aún más con cebadores adaptadores TitA_fwd, 5′ CGT ATC GCC TCC CTC GCG CCA G 3′ y TitB_rev, 5′ CTA TGC GCC TTG CCA GCC CGC TCA G 3′, utilizando el kit de polimerasa de ADN de alta fidelidad Phusion (Finnzymes) con condiciones de termociclado: desnaturalización inicial a 98 °C durante 30 s, luego 15 ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 7 s y recocido/extensión A 72 °C durante 30 s, seguido de un paso de extensión final a 72 °C durante 5 min., Los productos PCR fueron purificados con el kit concentrador-5 de Zymo DNA Clean &. El emparejamiento de HC y LC en los productos de ensamblaje se analizó mediante PCR utilizando cebadores anidados específicos para los tres diferentes HC y tres diferentes LC (archivo adicional 1: Figura S1e) utilizando el kit de ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion con las siguientes condiciones de termociclado: desnaturalización inicial a 98 °C durante 30 s, luego 24 ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 7 s y recocido/extensión A 72 °C durante 30 s, seguido de un paso de extensión final a 72 °C durante 5 min., Los productos de PCR anidados se cargaron en un gel de agarosa al 1,2% TBE y se separaron con 90 V durante 40 min. La PCR anidada en tiempo Real para la cuantificación de la contaminación cruzada se llevó a cabo en triplicados con los mismos cebadores anidados utilizando SYBRGreen master mix (Applied Biosystems) en un ciclador StepOne qPCR (Applied Biosystems) con las siguientes condiciones de termociclado: desnaturalización inicial a 95 °C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 15 s, recocido a 56 °C durante 30 s y extensión A 72 °C durante 45 s., Las abundancias iniciales de los productos de ensamblaje amplificados se calcularon utilizando el método 2^(- deltaCt) y se trazaron como gráficos de barras con barras de error que mostraban la desviación estándar de la media.
inmunización y aislamiento de células CD19+ B de muestras de sangre entera periférica
Las muestras de sangre entera periférica humana utilizadas en este estudio fueron obtenidas de in.vent Diagnostica GmbH como subproductos de procedimientos de diagnóstico rutinarios. en.,vent Diagnostica GmbH tiene el consentimiento informado por escrito del donante para utilizar los subproductos para la investigación y cuenta con una aprobación ética de la Comisión de Ética Internacional de Friburgo (código Feki 011/1763) para la distribución de muestras. Un proband sano se sometió a inmunización de refuerzo con toxoide tetánico(TT) / toxoide Diptérico (DT) (Td-pur®; 20 unidades internacionales TT y 2 UI DT; Novartis, Basilea, Suiza)., Se utilizó sangre entera periférica K2-EDTA derivada de la inmunización previa a la inmunización (día 0) y siete días después de la inmunización de refuerzo de la Td para aislar las células CD19+ B utilizando el kit de separación de células pluriBead CD19 (pluriSelect GmbH, Leipzig, Alemania) siguiendo el protocolo del fabricante. Los gránulos aislados de células CD19 + B se lavaron en 1 mL de PBS frío y se centrifugaron a 300 g durante 10 min a 4 ° C. Los gránulos de células correspondientes a 1,5 millones de células B de muestras anteriores y posteriores a la inmunización se mantuvieron en hielo hasta el tratamiento con cicloheximida y la preparación de microsomas.,
emulsión RT-PCR utilizando microsomas de células B humanas
agregamos 2 µL de microsomas diluidos preparados a partir de células ARH-77 congeladas (como control de emparejamiento interno) a 26 µL de microsomas resuspendidos de células B tanto antes como después de la inmunización con Td, de modo que la fracción final de microsomas ARH – 77 es del 0.5% (v / v). Diluimos 16 µL de esta suspensión de microsomas en 184 µL RT-PCR master mix conteniendo 1× DART 1-step RT-PCR master buffer mix (Roboklon), 2× Dart master enzyme mix (Roboklon), 0.,5 µg/µL BSA, 100 µg/mL de cicloheximida y cebadores para transcripción inversa (IgM, IgG e IgK) y ensamblaje de cadenas pesadas (VH) y ligeras (VK). Las secuencias de imprimación y las concentraciones en la mezcla maestra RT-PCR se enumeran en el archivo adicional 1: Tabla S2., Los 200 µL de solución acuosa resultantes se utilizaron para formar una emulsión de agua en aceite mediante adición gota a gota (13 alícuotas de 15 µL en intervalos de 30 s) a una fase de aceite de 800 µL compuesta por el componente 1 de emulsión al 73%, el componente 2 de emulsión al 7% y el componente 3 de emulsión al 20% del kit de emulsión y purificación de ADN Micélula (Roboklon) durante la agitación continua en un agitador magnético., Seis alícuotas de 100 µL cada una de la emulsión resultante se transfirieron a tubos de PCR y se sometieron a termociclado con las siguientes condiciones: transcripción inversa a 55 °C durante 30 min, desnaturalización inicial a 95 °C durante 3 min, luego tres ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 20 s, recocido a 56 °C durante 30 s y extensión A 72 °C durante 2 min, luego 20 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 20 s, recocido a 56 °C durante 30 s y extensión A 72 °C durante 4 min, seguida de un paso de extensión final a 72 °C durante 5 min., Los productos de ensamblaje de PCR se extrajeron de la emulsión utilizando isobutanol (2-metil-1-propanol, Sigma) y el kit concentrador-5 de Zymo DNA Clean & (Zymo Research) como se publicó anteriormente . Los ADN resultantes se cargaron en un gel de agarosa al 1% TBE y se separaron con 100 V durante 45 min. Los productos de ensamblaje de 700-800 PB se seleccionaron por tamaño del gel de agarosa, se recuperaron utilizando un kit de recuperación de ADN de Zymoclean Gel, se elutaron en 6 mM Tris-Cl pH 8 y se almacenaron a − 20 °C hasta un análisis posterior.,
amplificación de PCR anidada de productos de ensamblaje de células B humanas
para una amplificación adicional específica de los productos de ensamblaje HC-LC, se realizó una amplificación de PCR anidada con cebadores anidados específicos para regiones constantes IgM, IgG e IGK (archivo adicional 1: Tabla S2). La reacción PCR contenía cebadores anidados a concentraciones de 0,4 µM, mezcla de dNTP de 200 µM, tampón de reacción de 1× Q5 y polimerasa de ADN de alta fidelidad de 0,02 U / µL Q5 (New England Biolabs) en un volumen de reacción de 50 µL con 3 µL de ADN ensamblado., La amplificación de PCR anidada se realizó con las siguientes condiciones de termociclado: desnaturalización inicial a 98 °C durante 3 min, luego 34 ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 30 s y recocido/extensión A 71 °C durante 1 min, seguido de un paso de extensión final a 72 °C durante 5 min. Las muestras se recolectaron después de tres ciclos de PCR diferentes (28, 31 y 34 ciclos). Los productos de PCR amplificados se cargaron en geles de agarosa al 1% TBE y se separaron con 100 V durante 60 min., Los productos deseados de ~ 710 PB se extrajeron como se describió anteriormente, las bibliotecas de secuenciación se prepararon siguiendo la Guía de preparación de muestras de ADN de Illumina TruSeq y las lecturas de 2 × 250 bases emparejadas se secuenciaron utilizando la plataforma Illumina MiSeq.
El análisis bioinformático de los repertorios de anticuerpos apareados de cadenas pesadas y ligeras
se realizó la demultiplexación de 2 × 250 lecturas de base emparejadas de la plataforma de secuenciación MiSeq con base en índices de adaptadores y los datos de secuenciación se obtuvieron en formato fastq., Solo se retuvieron lecturas con puntajes mínimos de calidad Phred de 10 sobre el 50% de todos los nucleótidos y se escanearon para secuencias de región constante IgM, IgG e IgK. Los pares leídos que carecían de secuencias de Región constantes o que mostraban estructura HC-HC O LC-LC se filtraron y las lecturas restantes se convirtieron en formato fastq y se utilizaron como entrada para el análisis con MiXCR (v1.2) para la alineación de las lecturas a las secuencias de genes de referencia V(D)J y C de la base de datos IMGT , extracción y agrupación de nucleótidos CDR-H3 (archivo adicional 1: Tabla S1)., Las secuencias HC-CDR3 que contenían frameshifts o codones stop y con menos de dos lecturas fueron filtradas. Creamos un archivo de estadísticas de emparejamiento HC-LC para demostrar el uso del gen VH-VK emparejado en los repertorios de genes HC-LC emparejados totales. Los mapas de calor se generaron utilizando R y se mostraron gráficamente utilizando ggplot2. A continuación, se identificaron secuencias interindividuales de HC-CDR3 específicas de TT comparando las secuencias de aminoácidos de HC-CDR3 obtenidas de la muestra de inmunización de refuerzo post-Td con las secuencias de HC-CDR3 específicas de TT notificadas previamente .,
amplificación por PCR de secuencias completas de HC y LC
diseñamos un método de amplificación basado en PCR de dos pasos (archivo adicional 1: Figura S5) para incorporar sitios de digestión de restricción a HC y LC potencialmente específicos de TT con secuencia completa del gen V(D)J. Esto permitió la clonación eficiente de secuencias de HC y LC en vectores de expresión respectivos, así como la producción de anticuerpos recombinantes para estudios de unión in vitro., Brevemente, seleccionamos 14 clonotipos pareados de HC-LC CDR3 obtenidos de la secuenciación de IgG después de la inmunización de refuerzo de Td en función de su frecuencia, precisión de emparejamiento y diferencia de dobleces entre top1 LC-CDR3 y top2 LC-CDR3 emparejados a la secuencia dada de HC-CDR3. Se extrajo ARN total de las células B congeladas aisladas de la inmunización de refuerzo post-Td utilizando el reactivo TRIzol (Ambion) de purificación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En el primer paso, la amplificación RT-PCR para cada clonotipo seleccionado HC – y LC-CDR3 se realizó por separado utilizando el Dart 1-step RT-PCR kit (Roboklon)., La mezcla maestra RT-PCR (25 µL) contenía cebadores delanteros específicos de genes HC y LC V con voladizos de sitio de restricción BssHII junto con cebadores inversos específicos de CDR3 individuales con 18 nucleótidos de Región FR4 a concentraciones de 0,4 µM (archivo adicional 1: Tabla S3 y figura S5), 1× DART 1-step RT-PCR master buffer mix, 1× Dart master enzyme mix, y 4,5 ng de ARN total., Las condiciones de termociclado fueron las siguientes: transcripción inversa a 55 °C durante 30 min, desnaturalización inicial a 95 °C durante 3 min, luego 23 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 20 s, recocido a 56 °C durante 30 s y extensión A 72 °C durante 90 s, seguido de un paso de extensión final a 72 °C durante 5 min. Los productos RT-PCR se purificaron utilizando el kit de purificación Agencourt AMPURE XP – PCR (Beckman Coulter) siguiendo las instrucciones del fabricante y se elutaron en 6 mM Tris-Cl pH 8.0., En el segundo paso, se utilizaron productos purificados de RT-PCR como plantilla para la amplificación de PCR utilizando la polimerasa de ADN de alta fidelidad Q5 (New England Biolabs). La mezcla maestra de PCR anidada (50 µL) contenía cebadores directos que codificaban un sitio de restricción BssHII y tres nucleótidos de secuencia de genes de la línea germinal HC O LC junto con cebadores inversos que contenían la región FR4 completa y salientes de restricción Nhei/HindIII a concentraciones de 0,4 µM (archivo adicional 1: Tabla S3 y figura S5), 4 µL de ADN purificado, mezcla dNTP de 200 µM, 1× tampón de reacción Q5 y 0.,02 U / µL Q5 ADN polimerasa de alta fidelidad (New England Biolabs). Las condiciones de termociclado fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 98 °C durante 3 min, luego 16 ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 30 s, recocido a 69 °C durante 30 s y extensión A 72 °C durante 1 min, seguido de un paso de extensión final a 72 °C durante 5 min. Los productos de PCR se separaron en un gel de agarosa TBE, amplicones de HC y LC de longitud completa con sitios de digestión de restricción se extrajeron del gel utilizando el kit de recuperación de ADN de Gel Zymoclean (Zymo Research) y los productos se almacenaron a − 20 °C hasta su uso posterior.,
clonación y expresión de anticuerpos monoclonales recombinantes
la digestión de restricción de insertos de HC y LC de longitud completa y vectores de expresión (pCMV-CD30-4IE3_HC y pCMV-CD30-4IE3_LC) se realizó con las enzimas de restricción BssHII, Nhei e HindIII (New England Biolabs). Los productos resultantes se cargaron en geles de agarosa al 2% TBE y bandas de ~ 5.9 kb para la columna vertebral del vector HC, 5.3 kb para la columna vertebral del vector LC, ~ 370 PB para insertos HC y ~ 340 PB para insertos LC se seleccionaron por tamaño en geles de agarosa y se purificaron como se describió anteriormente., Las ligaciones de los insertos y vectores correspondientes para los clonotipos amplificados de HC y LC se realizaron utilizando ligasa de ADN de extremo adhesivo instantáneo (New England Biolabs) y se transformaron en células de E. coli Top10 (IBA) químicamente competentes siguiendo las instrucciones del fabricante. Se aislaron ADN plásmidos de colonias transformadas (8-16 colonias) utilizando el kit qiaprep spin miniprep (Qiagen); se confirmaron similitudes con las secuencias de consenso utilizando la secuenciación capilar de Sanger., Las secuencias de ADN plásmido de HC y LC que coincidían más cerca de las secuencias de consenso fueron co-transfectadas a células de la línea celular de riñón embrionario humano HEK 293 T (ATCC, CRL-11268). Se cultivaron células T HEK 293 utilizando glucosa Rica (4.5 g/L D-glucosa) medio de Eagle modificado de Dulbecco (Gibco BRL) suplementado con suero fetal bovino de IgG ultra baja inactivada por calor (Thermo Fisher Scientific), 100 U/mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina. Los ADN de plásmidos purificados para clonotipos pareados de HC y LC se co-transfectaron a 85-95% de células T confluentes de HEK 293 utilizando PEI (polietilenamina, Polisciencias)., Se recolectaron sobrenadantes de cultivo cuatro días después de la transfección y se identificaron clonotipos específicos del antígeno TT mediante ELISA indirecta.
Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA)
realizamos ensayos ELISA indirectos para identificar mAbs derivados del proband inmunizado que se une al antígeno TT utilizando los sobrenadantes de cultivo celular transfectados. Las placas sólidas Nunc-Immuno MicroWell de 96 pocillos (Thermo Fisher Scientific) se recubrieron con 100 µL de antígeno TT de 10 µg/mL (Statens Serum Institute, Copenhague, Dinamarca) en tampón de carbonato de 50 mM pH 9.,6, incubado durante la noche a 4 ° C, lavado tres veces con PBS y bloqueado con leche en polvo sin grasa al 2% (Bio-Rad) en PBS durante 150 min a temperatura ambiente. Después del bloqueo, se añadieron a los pocillos 120 µL de sobrenadantes transfectados 1:2 diluidos en serie en PTM (PBS, 0,1% Tween-20, 2% leche en polvo descremada), se aplicaron 350 ng de mouse anti-TT MAB (GeneTex) a un pocillo como control positivo y se incubaron placas durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con PBS-T (0.,1% Tween-20) y 50 µL de una dilución 1:2000 de anticuerpo secundario caprino anti-humano kappa LC-HRP (Thermo Fisher Scientific) se agregaron a los pocillos, 50 µL de una dilución 1:2000 de anticuerpo secundario caprino anti-ratón IgG HC-HRP (Sigma #A0168) se agregaron al pocillo de control positivo, las placas se incubaron durante 2 min a temperatura ambiente y se lavaron tres veces con PBS-T. para el desarrollo del color, se agregaron 50 µL de sustrato TMB-Elisa (Thermo Fisher Scientific) por pocillo, incubó las placas durante 5 min a temperatura ambiente y detuvo la reacción de unión AG:AB mediante la adición de 50 µl 2 m H2SO4., La absorbancia se midió a 450 nm utilizando el GloMax Multi Detection System (Promega). Los ensayos ELISA para todos los clonotipos se realizaron en triplicados, los valores se normalizaron para eliminar las señales de fondo y los errores se representaron como desviaciones estándar de la media.
análisis de la formación de amplicones quiméricos durante la PCR anidada
se generaron cuatro amplicones HC-LC definidos amplificando el HC y el LC de los respectivos plásmidos pCMV (ver arriba) y utilizando una reacción de ensamblaje PCR para generar los cuatro conjuntos HC-LC distintos., Se utilizaron DNAs de plásmidos HC y LC como plantillas para la amplificación por PCR de los pares de cadenas clonales Top1, Top2, Top3 y Top4 utilizando cebadores específicos para las respectivas familias de genes VH y VK y regiones constantes IgG e IgK (archivo adicional 1: Tabla S2 y figura S6a). Se añadió ADN plásmido purificado (10 ng) a cada reacción PCR de 25 µL que contenía 0,4 µM de cada imprimación, 200 µM de mezcla dNTP, 1× tampón de reacción Q5 y 0,2 U/µL Q5 de ADN polimerasa de alta fidelidad., El ciclo térmico se realizó con desnaturalización inicial a 98 °C durante 3 min, seguido de 25 ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 30 s, recocido/extensión A 71 °C durante 1 min (para ADN plásmido HC) o recocido a 64 °C durante 1 min y extensión A 72 °C durante 1 min (para ADN plásmido LC), seguido de un paso de extensión final a 72 °C durante 5 min. Los productos PCR se cargaron en geles de agarosa al 1% TBE separados y se separaron con 100 V durante 60 min. Los productos de ADN deseados de ~ 400 PB (para HC) y ~ 350 PB (para LC) fueron seleccionados por tamaño y extraídos del gel como se describió anteriormente., Los productos PCR de HC y LC purificados se utilizaron como plantillas para el ensamblaje de HC y LC por PCR de extensión de superposición (archivo adicional 1: Figura S6b). Brevemente, se agregaron 5 ng de cada HC y el ADN LC Pareado correspondiente a cada reacción PCR de 50 µL que contenía 1× Dart 1-step RT-PCR master buffer (Roboklon), 2× Dart Master enzyme (Roboklon) y 0.4 µM de cada imprimador de región constante IgG e IgK (archivo adicional 1: Tabla S2)., El ciclo térmico se realizó con inactivación RT a 95 ° C durante 3 min, seguido de tres ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 20 s, recocido a 56 °C durante 30 s y extensión A 72 °C durante 2 min, seguido de 25 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 20 s, recocido a 56 °C durante 30 s y extensión A 72 °C durante 4 min, seguido de un paso de extensión final a 72 °C durante 5 min. Los productos de montaje se cargaron en geles de agarosa al 1% TBE y se separaron con 100 V durante 45 min. Los productos de ensamblaje de ~ 750 PB fueron seleccionados por tamaño y extraídos del gel de agarosa como se describió anteriormente., Los pares clonales HC-LC ensamblados individualmente se agruparon y se utilizaron como plantilla para la amplificación de PCR anidada con cebadores específicos para regiones constantes IgG e IgK (archivo adicional 1: Tabla S2, figura S6c). La reacción de PCR anidada y las condiciones de ciclo térmico fueron las mismas que se describen en la sección «amplificación de PCR anidada de productos de ensamblaje de células B humanas», excepto que la amplificación de PCR se realizó durante 25 ciclos. Los productos PCR se cargaron en geles de agarosa al 1% TBE, se separaron con 100 V durante 60 min y se extrajeron los productos deseados de ~ 720 PB como se describió anteriormente., Las bibliotecas de secuenciación de los ensamblajes individuales y de los ensamblajes mixtos después de la PCR anidada se prepararon siguiendo la Guía de preparación de muestras de ADN de Illumina TruSeq y se generaron lecturas de 2 × 250 pares de bases utilizando la plataforma Illumina MiSeq.