«la secuenciación de ARN es un método de secuenciación de próxima generación de alto rendimiento utilizado para analizar la expresión génica y los estudios de transcriptómica.»
El ácido ribonucleico es un tipo de ácido nucleico que participa principalmente en la expresión génica, la regulación génica y la codificación/decodificación de la información.
ARNm – ARN mensajero es una secuencia codificante de un gen implicado en la síntesis de proteínas, aproximadamente, el 4% del grupo de ARN consiste en ARNm mientras que el resto son ARN no codificantes.,
aunque aproximadamente el 90% del ARN no codifica, estos son importantes para realizar varias funciones.
por ejemplo,
- tRNA-transfiere el aminoácido al sitio ribosomal, mientras que la traducción.
- rRNA – ARN ribosomal ayuda en la traducción.
- microRNA-expresión génica y regulación de la expresión génica.
- siRNA-protege una célula de los ARN exógenos.
un ARNm es un ácido nucleico monocatenario transcrito a partir de un gen y del cual se traduce la proteína.,
el ARNm o transcripción contiene solo las secuencias codificantes de un gen. Por lo tanto, solo posee las secuencias que se requieren en la formación de proteínas.
en adelante, mediante el análisis de un ARNm, se puede determinar el patrón de expresión del gen relacionado.
Además, el examen total de ARN nos da una idea de qué genes están vinculados a la formación de proteínas y cuáles no.
significa que la cantidad de ARN total, ARNm y ncRNA se puede determinar mediante el estudio del ARN total.,
La transcriptómica es el estudio de todo el ARNm, a menudo llamado transcriptomas o ARN total presente en una célula o población celular.
mediante el análisis del transcriptoma de una célula, se puede examinar todo el conjunto de la expresión génica. Una de las técnicas importantes utilizadas en los estudios de transcriptómica es la secuenciación del ARN.
el transcriptoma de un organismo es más grande, complejo y más incierto, a diferencia del genoma.
El transcriptoma varía en diferentes condiciones y en un entorno diferente., El estilo de vida, la dieta, el ejercicio, el entorno, las condiciones y otros factores externos desempeñan un papel importante en la regulación del transcriptoma.
aquí, en la secuenciación de ARN, el ADNc sintetizado a partir del ARNm se secuenció y cuantificó en un secuenciador. En el presente artículo, vamos a discutir la secuenciación de ARN solo, pero antes de que lea nuestro artículo anterior sobre transcriptómica: ¿Qué es la transcriptómica?,
temas clave:
principio de secuenciación de ARN:
la secuenciación de ARN es un método de secuenciación y cuantificación de ARN de próxima generación y alto rendimiento utilizado para estudiar la transcriptómica y la expresión génica.
a cDNA is constructed from total mRNA through the process of reverse transcription and fragmented. Simultáneamente, la ligadura del adaptador y la preparación de la biblioteca se practican antes de hacer la secuenciación.
el secuenciador Lee y cuantifica el ADNc complementario al ARNm.,
Steps in RNA-seq:
- RNA isolation
- cDNA synthesis
- Adaptor ligation
- Library preparation
- DNA fragmentation
- Sequencing
- Downstream applications
RNA isolation:
The first step in the RNA sequencing is the isolation of total RNA, mRNA or ncRNA for the experiment.,
aislar el ARN es un proceso tedioso en comparación con el aislamiento del ADN. El ARN se puede descomponer fácilmente. Además, la posibilidad de contaminación es alta en el aislamiento de ARN.
por lo tanto, se debe tener un cuidado extra mientras se aísla el ARN y se requiere la mano de un experto para hacerlo.
el ARN puro de alto rendimiento debe requerirse para la secuenciación del ARN.
la pureza y la cantidad del ARN se miden utilizando el Nanodrop o qubit.
Note: for isolating mRNA from the total RNA pool, one additional step is required, using the oligo dT specific column in the purification or final step of elution, total mRNA can be isolated from the rest of RNAs.
ahora nuestra muestra de ARN está lista para el siguiente paso.,
Reverse transcriptase PCR:
otra configuración innovadora para la secuenciación de ARN es hacer la transcriptasa inversa PCR en la que el ARN se transcribe a ADN.
utilizando un tipo especial de polimerasa conocida como ADN transcriptasa inversa, el ADNc se sintetiza a partir del ARNm.
Obtenga más información sobre RT PCR aquí: Reverse transcriptase PCR.
segunda cadena de síntesis de ADNc:
después del ADNc sintetizado a partir del ARNm, se debe requerir la segunda cadena de síntesis de ADN. Para ello, la PCR se realiza utilizando la ADN polimerasa Taq normal en PCR convencional.,
la polimerasa agrega dNTPs a la cadena de ADN en crecimiento usando el conjunto de imprimación.
preparación de la Biblioteca:
el primer paso en la preparación de la biblioteca o preparación de la biblioteca NGS comienza con las fragmentaciones.
utilizando el tipo especial de endonucleasas de restricción, todo el conjunto de ADNc ds se fragmenta para el NGS.
Nota:
la preparación de la biblioteca varía de plataforma a plataforma, ya que algunos fragmentos de ARNm antes de realizar la transcriptasa inversa, mientras que algunos lo realizan más tarde después de la preparación del ADNc.,
en el último paso de la preparación de la biblioteca, los extremos se ligan con las secuencias de adaptador y se amplifican para reparar los extremos. dA-tailing es opcional en el caso de la biblioteca mRNA.
purificación de la Biblioteca:
toda la biblioteca se purifica utilizando el kit de purificación de ADN listo para usar.
en el último paso, es muy importante purificar toda la biblioteca de fragmentos para que la concentración de la biblioteca se evalúe utilizando la PCR cuantitativa o bioanalizador.,
Nota:
para un principiante creo que la preparación de la biblioteca y la fragmentación del ADN es muy difícil de entender, por lo que pensamos, deberíamos escribir un artículo completo sobre la fragmentación del ADN genómico, la preparación de la biblioteca y su importancia en NGS.
de todos modos vamos a seguir adelante,
en el siguiente paso, la muestra de ADN fragmentado se envía para la secuenciación.
secuenciación de ADN:
ahora la muestra se secuenciaen la máquina NGS de alto rendimiento que lee la secuencia y cuantifica el ácido nucleico también.,
la química detrás de la secuenciación del ADNc depende de qué plataformas estamos utilizando, aunque el método ampliamente utilizado es el uso de la química de fluorescencia.
en el secuenciador, los fragmentos individuales se «leen» por separado y se secuencian. Los datos finales se envían al laboratorio de bioinformática para su análisis posterior a la secuenciación.,
Different types of RNA and its function:
| Abbreviation | RNA types | Function |
| mRNA | Messenger RNA | Codes for protein |
| tRNA | Transfer RNA | Transfer amino acid to the site of translation., |
| rRNA | Ribosomal RNA | Catalyse the translation reaction |
| miRNA | microRNA | Gene regulation |
| siRNA | Smaller interfering RNA | Gene regulation and maintaining gene expression. |
| LncRNA | Long non-coding RNA | Transcriptional regulation and epigenetic regulations., |
| snRNA | Small nuclear RNA | Helps in mRNA splicing and related functions |
| snoRNA | Small nucleolar RNA | Helps in RNA nucleotide modification |
| piRNA | Piwi-intercalating RNA | Function in defence against transposon; transposon defence system. |
| scaRNA | Small Cajal body-specific RNA | Also helps in nucleotide modifications (a type of snoRNA)., |
| shRNA | small hairpin RNA | la molécula de ARN sintético ayuda en la regulación génica y el control de la expresión génica. |
Transcriptome data analysis:
uno de los trabajos tediosos, como ya comentamos en el artículo anterior, es el análisis de datos de transcriptome e interpretación de resultados. Los datos de NGS son enormes y más complejos.,
Francamente hablando, la enseñanza del análisis de datos de la transcriptómica no es posible, uno debería tener que tomar práctica práctica para aprender, aún así, trataré de enseñarte lo que sigue en este proceso.
se secuencian diferentes fragmentos en la máquina y se recopilan datos. En el siguiente paso, basado en la región de flanqueo de los fragmentos, los llamados «contings» están dispuestos para obtener variantes de empalme.
en el siguiente paso, el transcriptoma se compara con la secuencia de referencia o se puede ensamblar de novo.,
Una breve descripción de todo el proceso de RNA-seq.
secuenciación del transcriptoma completo:
el transcriptoma completo de una célula o tejido: todos los ARN (ARNm, ARNt, ARNr, sncRNA, microRNA y ARNip) se secuencian y cuantifican. En otras palabras, podemos decir que tanto la novela como las transcripciones conocidas pueden ser secuenciadas.
para hacerlo, se extrae todo el conjunto de ARN de la muestra de tejido.,
secuenciación del ARN Diana:
en la secuenciación del ARN Diana se secuencian un grupo de transcriptomas específicos del gen, específicos de una vía o relacionados con la enfermedad.
la secuenciación del ARN objetivo es más asequible y precisa que toda la secuenciación del transcriptoma. Además, se requiere menos cantidad de muestra de ARN para hacer el experimento.
secuenciación de ARN pequeño:
una de las técnicas más emergentes en la secuenciación de ARN es estudiar el ARN no codificante más pequeño de una célula porque están asociados con tantas funciones en un genoma.,
Las moléculas más pequeñas del ARN tales como miRNA, siRNA y piRNA se pueden cuantificar y secuenciar con el método de secuenciación basado NGS del ARN para diversas aplicaciones.
secuenciación del ARNm:
secuenciar la transcripción completa del ARNm utilizando la selección de cola de poli(A) utilizada para los estudios de expresión génica. El uso de la secuenciación de ARNm conocida, así como la alteración de transcripción nueva puede ser detectado.
ventajas de la secuenciación de ARN:
una de las ventajas fundamentales de la secuenciación de ARN es la no necesidad de información previa de la secuencia., Como todo el proceso no se basa en la química basada en la sonda, no se requiere información previa de secuencia para diseñar la sonda.
se puede realizar un estudio de expresión génica más preciso y sensible.
rango dinámico más amplio.
captura tanto alteraciones conocidas como novedosas de la transcripción, incluso si no hay información de secuencia disponible.
aunque no hay información de secuencia de referencia disponible, la secuenciación de ARN se puede aplicar para cualquier especie.
relacionado: genoma sintético-métodos, aplicaciones y desafíos.,
conclusión:
concluyentemente podemos decir que el método seq de ARN es más avanzado y preciso en comparación con el microarray. También, las mutaciones de novo también se pueden descubrir usando él.