GLP-1 AND INSULIN SECRETION
Overview of the ATP-sensitive pathway.
la secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS) está regulada por una serie de vías de señalización iónicas y no iónicas, también conocidas como las vías dependientes e independientes de KATP (34,35). El mecanismo dependiente de KATP del acoplamiento estímulo-secreción se revisa en la Fig. 1., En general, la célula β adapta la secreción de insulina a los niveles de glucosa prevalecientes en la sangre a través del metabolismo de la glucosa. Cuando los niveles de glucosa aumentan, la tasa de glucólisis aumenta, lo que genera sustratos (principalmente piruvato) para el metabolismo oxidativo mitocondrial, cuyo resultado es la generación de ATP, o más correctamente un aumento en la relación ATP-ADP (36). Este evento proporciona el vínculo funcional entre un estímulo de glucosa y la secreción de insulina., El aumento de esta relación causa el cierre de los canales KATP de células β, lo que lleva a la despolarización de la membrana plasmática, la activación de los canales Ca2+ dependientes de voltaje (VDCCs) y un aumento de la concentración intracelular de Ca2+ (i), el principal desencadenante de la secreción de insulina. Es probable que la repolarización de las células β esté mediada por canales K+ (Kv) dependientes de voltaje y canales K+(KCa) sensibles a Ca2+ (37), que se abren en respuesta a la despolarización de la membrana inducida por glucosa para restaurar el flujo exterior de K+., GLP-1 se propone para modular GSIS mediante la regulación de la actividad de varios canales iónicos involucrados en la secreción de insulina dependiente de KATP, así como pasos distales a la modulación del canal.
canales GLP-1 y β-cell KATP.
uno de los muchos efectos celulares observados de GLP – 1 es la inhibición de los canales KATP de células β (38-40). La despolarización de la membrana resultante inducida por el cierre del canal KATP inicia la afluencia de Ca2 + a través de VDCCs y desencadena la liberación exocitótica de insulina., La figura 2 muestra el efecto excitador del GLP-1 sobre el potencial de membrana y su efecto inhibitorio tanto sobre las corrientes nativas del canal KATP de las células INS-1 como sobre las corrientes mediadas por los canales recombinantes KATP (SUR1/Kir6.2) coexpresados con el receptor GLP-1 en una línea celular de mamíferos. Las consecuencias fisiológicas del cierre del canal KATP facilitado por GLP-1 serían 1) aumentar la excitabilidad de las células ya por encima del umbral para la liberación de insulina y 2) aumentar el porcentaje de células β que secretan insulina activamente a concentraciones de glucosa normalmente por debajo del umbral para la liberación de insulina.,
La Opinión de consenso es que el efecto inhibitorio del GLP-1 en los canales KATP es dependiente de cAMP / PKA (38-41), aunque un estudio con células β de rata no está de acuerdo (42). Esta afirmación de Suga et al. (42) Se basa en su hallazgo de que el inhibidor específico de la PKA Rp-cAMPS (100 µmol/l) fue incapaz de prevenir la despolarización celular y la reducción de la corriente KATP de toda la célula provocada por el GLP-1. La integridad de la inhibición de la PKA por Rp-cAMPS debe ser cuestionada porque en el mismo estudio, la forskolina indujo secreción significativa de insulina incluso en presencia de Rp-cAMPS. En segundo lugar, Suga et al., sugieren que el GLP-1 causa un ligero aumento en la sensibilidad ATP del canal KATP de tal manera que a bajas concentraciones MICROMOLARES de ATP, el canal KATP será más susceptible al cierre. Sin embargo, en la célula β pancreática normal de rata, los niveles milimolares de ATP están presentes (43), y en estos niveles fisiológicos de ATP, la probabilidad abierta del canal KATP (Po) muy similar en ausencia y presencia de GLP-1 se predice de la siguiente manera. Nuestros cálculos indican que con un intracelular de 2 mmol / l, el canal KATP Po se reduce de 0,005 a 0,003 en presencia de GLP-1., Es plausible que un desplazamiento hacia la izquierda de la sensibilidad del ATP ocurra en presencia de GLP-1. Sin embargo, la magnitud observada de la reducción de la corriente KATP inducida por GLP-1 observada en registros de pinza de parche de células enteras (Fig. 2) es probablemente demasiado grande para ser explicado únicamente por las pequeñas disminuciones en Po calculadas a partir de los datos de Suga et al. (42). Un trabajo reciente de nuestro laboratorio ha demostrado que el inhibidor de PKA específico de permeante de membrana H-89 (44) es capaz de inhibir completamente la reducción de corriente KATP por GLP-1 (45)., Además, otros han mostrado resultados similares usando Rp-8-Br-cAMPS, un análogo más permeable a la membrana de Rp-cAMPS (38,41). Las acciones de GLP-1 en los canales KATP también pueden involucrar otras vías de señalización porque se demostró que la inhibición del canal KATP por GLP-1 en células β de ratón es dependiente de calmodulina, utilizando los inhibidores de calmodulina W-7 y calmidazolio (46).
la dependencia de glucosa de las acciones de GLP-1 ha sido bien establecida, aunque los mecanismos precisos para esta dependencia no están claros (41,47)., Sin embargo, las acciones celulares de la PKA en el canal KATP pueden proporcionar un vínculo entre esta quinasa y la sensibilidad a la glucosa de GLP-1. Otros grupos han demostrado que la adición de la subunidad catalítica de PKA (cPKA) a parches extirpados que contienen canales KATP resulta en un aumento de la corriente KATP (39,48). Nuestro laboratorio ha demostrado recientemente que el efecto de la cPKA sobre la corriente KATP depende del ADP (45). Cuando los niveles de ADP son elevados, cPKA aumenta la corriente del canal KATP en un sistema recombinante, consistente con los resultados de Lin et al. (39)., Por el contrario, a medida que disminuyen los niveles de ADP, la cPKA reduce la corriente KATP (45). Fisiológicamente, esto puede resultar en una mejora insignificante de la excitabilidad de las células β cuando los niveles de glucosa son bajos (altos ), mientras que cuando los niveles de glucosa aumentan (Bajos ), el cierre mediado por GLP-1 de los canales KATP, a través de una vía dependiente de PKA, conduce a la despolarización de la membrana y los aumentos posteriores en la excitabilidad de las células β., Se debe prestar especial atención a la relación ATP-ADP celular cuando se considera la actividad del canal KATP porque son los cambios en esta relación, más que simplemente los cambios en el intracelular per se, los que gobiernan la actividad de los canales KATP en la célula β intacta. El ATP libre está altamente tamponado dentro de la célula por la membrana y las Atpasas citosólicas (43) y se prevé que no cambie significativamente con el aumento del metabolismo de la glucosa (36). Por el contrario, el cambio recíproco en el ADP, que no está amortiguado en la misma medida, es más significativo y resulta en un cambio en la relación ATP-ADP (36)., De hecho, la importancia del ADP en el control de la actividad del canal KATP de las células β se ha demostrado porque las mutaciones en la región de detección de ADP del canal KATP humano conducen a la secreción incontrolada de insulina y la hipoglucemia (49). La identidad molecular del Sitio(s) de fosforilación de PKA es de importancia significativa y todavía está bajo investigación. Tanto el Kir6.,Las subunidades 2 y SUR1 del canal KATP contienen secuencias objetivo putativas para la fosforilación mediada por PKA (39,48), y la mutación sistemática de estos residuos debe aclarar las contribuciones relativas de estos Sitios a la acción de PKA en el canal KATP.
GLP-1, VDCCs y depósitos intracelulares de Ca2+.
se ha demostrado que el GLP-1 Mejora las corrientes a través de los VDC en células β de ratón, rata y humanos (38,50–52), aunque la magnitud de este efecto varía y a menudo no alcanza significación estadística., En células β humanas individuales, se demostró que el GLP-1 aumentaba la actividad del CCVD tipo L y la amplitud de los transitorios intracelulares de calcio evocados por la despolarización, un efecto que representó el 40% del aumento de la exocitosis potenciada por el GLP-1 (52). Aunque los VDC de tipo L son considerados clásicamente como los principales reguladores del influjo de Ca2+ que conduce a la secreción de insulina, se sabe que las células β expresan múltiples isoformas del canal Ca2+ (53). Pereverzev et al. (54) informaron recientemente que los ratones que carecen de la isoforma A1E de Cav2.3 tienen una tolerancia reducida a la glucosa y una disminución de las respuestas de insulina a la glucosa., Ellos especulan que la regulación de la proteína G de este canal puede modular la secreción de insulina basada en la regulación del receptor de acetilcolina muscarínica de las Ccdv in vitro (55).
hemos encontrado en células de insulinoma HIT-T15 transfectadas con el receptor GLP-1 que el GLP-1 causa un aumento en las corrientes Ca2+ dependientes del voltaje (ver 56 y Fig. 3A). Esto se debe, al menos en parte, a un cambio hacia la izquierda en la dependencia del voltaje de la activación que recuerda el efecto de la fosforilación de VDCC por PKA (57,58)., También observamos un cambio hacia la derecha en la dependencia de voltaje de la inactivación en estado estacionario de tal manera que en presencia de GLP-1, menos canales fueron efectivamente inactivados en un potencial de retención dado (50). Esto es apoyado por Britsch et al. (50), que sugieren que el tratamiento GLP-1 de las células β del ratón ralentiza la inactivación de las corrientes Ca2+ dependientes del voltaje. Además, el GLP-1 condujo a un aumento del calcio intracelular solo después de la adición de glucosa, un efecto que fue bloqueado en parte por los antagonistas de VDCC (Fig. 3C)., La capacidad de GLP-1 para mejorar las corrientes de Ca2+ es, al igual que el efecto en los canales KATP, dependiente del campo (51,52), basado en la capacidad de los campos Rp para prevenir un aumento de las corrientes. De hecho, el tratamiento de células β de rata con AMP cíclico de dibutirilo, un análogo de cAMP permeable a la membrana, replicó el efecto de GLP-1 sobre las corrientes de Ca2+ (51)., Además, en nuestros estudios (56), la respuesta de VDCC a GLP-1 se perdió en las células HIT-T15 que expresaban un receptor mutante de GLP-1 que carecía de residuos críticos necesarios para el acoplamiento a la adenilil ciclasa, mientras que la actividad de VDCC todavía podría ser mejorada por el agonista independiente de cAMP BAYK8644. Evidencia reciente sugiere que una proteína de anclaje a-quinasa (AKAP), AKAP18, se dirige a PKA a VDCCs y que esta quinasa puede estar involucrada en la modulación GLP-1 de estos canales (59).,
además de los efectos sobre los Ccvd, el GLP-1 puede movilizar los depósitos de calcio intracelulares de una manera dependiente de cAMP (60,61), posiblemente contribuyendo a la respuesta oscilatoria I al GLP-1 observada en las células HIT-T15 (Fig. 3C) (62). Nuestros estudios sugieren que la aplicación de GLP-1 da lugar a oscilaciones en I en células HIT-T15 y que estas oscilaciones no son abolidas (aunque se ven disminuidas en amplitud) por la eliminación de Ca2+ extracelular o por bloqueo VDCC (Fig. 3C)., De hecho, en varios tipos celulares, las oscilaciones de Ca2+ inducidas por un agonista son causadas principalmente por la liberación de Ca2+ a través de inositol trifosfato (IP3) y/o almacenes sensibles a la rianodina (63-65). En las células β, GLP-1 moviliza las reservas de Ca2+ en gran parte sensibilizando el receptor de rianodina (probablemente la isoforma tipo 2, RYR-2) al proceso de liberación de Ca2+inducida por Ca2+ (CICR) (61,66). Varios estudios han demostrado que el GLP-1 puede aumentar el I de una manera independiente de la PKA (67-69)., Este mecanismo se ha atribuido recientemente al CICR a partir de depósitos sensibles a la rianodina a través del factor II de intercambio de nucleótidos de guanina regulado por el cAMP (GEF-II o Epac2) y su interacción con la proteína G pequeña relacionada con el Ras Rap1 o con el efector de proteína G pequeña Rab3 Rim2 (68). Se ha demostrado la importancia de cAMP-GEF-II-Rim2, porque la inactivación de este complejo (por oligonucleótidos antisentidos o construcciones mutantes) atenuó la respuesta secretora de islotes de ratón o células de insulinoma MIN6 a GLP-1 (67)., Because the affinity of cAMP for PKA is much higher (∼100 nmol/l) compared with cAMP-GEF-II (cAMP 10 mmol/l), it is interesting to speculate that the GLP-1-stimulated cAMP-GEF-II pathway might operate on a rise in local cAMP rather than global changes., Aunque la señalización del receptor GLP-1 estimula la producción de IP3 en las células COS que expresan el receptor GLP-1 (70), un papel para las reservas de Ca2+ sensibles a IP3 en el I global está en duda porque la producción de IP3 estimulada por GLP-1 en las células β primarias es mínima (71,72) y el antagonista del receptor IP3 xestospongin C no pudo bloquear la liberación de reservas intracelulares de Ca2+ por el tratamiento forskolin (68). Sin embargo, la liberación de Ca2+ regulada por IP3 de los gránulos de insulina ha sido sugerida por los estudios de Nakagaki et al., (62), que sugieren que el GLP-1 puede regular de manera única la liberación temporal y espacial de calcio intracelular a través de la señalización local IP3. Por lo tanto, la liberación mediada por GLP-1 de los almacenes intracelulares, junto con la potenciación de la entrada de Ca2+ a través de VDCCs, probablemente contribuyen al efecto insulinotrópico de GLP-1.
canales KV de GLP-1 y células β.
Las corrientes K+ dependientes del voltaje, como las mediadas por canales Kv o KCa, median la repolarización de las células β después de un estímulo despolarizante, como la glucosa (37)., Recientemente, reportamos que los canales de la familia Kv1 y Kv2 regulan la secreción de insulina, porque el nocaut funcional dominante-negativo de cualquiera de estas familias de canales mejoró el GSIS (73). Los canales Kv2.1 median la mayoría de este efecto (>60%), cuyo mecanismo implica la depolarización de membrana estimulada por glucosa mejorada y la entrada de Ca2+ (observaciones no publicadas). Debido a que las corrientes kV de células β son potentes reguladores dependientes de la glucosa de la secreción de insulina, planteamos la hipótesis de que los secretagogos fisiológicos, como el GLP-1, pueden regular la función del canal Kv., De hecho, informamos en otra parte de este suplemento que el agonista del receptor GLP-1 exendina 4 inhibe las corrientes externas K+ dependientes de voltaje en células β de rata sujetas a voltaje en la configuración de células completas en un 40% y prolonga significativamente el curso de tiempo de repolarización de células β después de la despolarización transitoria por inyección de corriente. Esto se compara con una reducción del 86% en las corrientes de K+ hacia el exterior lograda con el antagonista general del canal kV tetraetilamonio. GLP-1 antagonizado voltaje-dependiente hacia fuera K+ corrientes en ratas β-células en ausencia de glucosa., Sin embargo, este efecto todavía puede contribuir a la dependencia de la glucosa del efecto insulinotrópico de GLP-1, porque normalmente no se espera que los canales Kv estén activos hasta después de una despolarización inducida por glucosa de la membrana celular (37). Además, y similar al efecto de GLP-1 en los otros canales iónicos mencionados anteriormente, la inhibición mediada por exendina 4 de los canales kV de células β depende de la señalización cAMP. Un estudio reciente, sin embargo, sugirió que la señalización cAMP no era suficiente en sí misma para antagonizar las corrientes K+ dependientes del voltaje en una línea celular secretora de insulina (INS-1) (74).,
numerosos estudios han descrito los efectos de las alteraciones mediadas por hormonas en las corrientes K+ dependientes del voltaje, tanto excitatorias como inhibitorias. El mejor caracterizado de estos efectos es el voltaje-dependiente K+ corriente downregulation en linfocitos y upregulation en miocitos cardíacos (75,76). En ambos tejidos, la vía de señalización cAMP/PKA ha sido implicada en la regulación de estos canales (76,77)., Los informes sugieren que el cAMP puede reducir las corrientes K + dependientes de voltaje en los linfocitos murinos (76) y una línea celular hipofisaria (78), pero mejorar las corrientes K+ dependientes de voltaje en los miocitos cardíacos (77), un hallazgo que se ha confirmado a nivel de canal único en los miocitos auriculares de rana (79) y el axón del calamar gigante (80)., La fosforilación puede ocurrir directamente en el canal, porque la fosforilación PKA de un canal kV auricular cerca del NH2-terminal mejora la actividad del canal (81), y la fosforilación de las subunidades α del canal Kv1 regula el grado de inhibición de estos canales conferidos por una subunidad β reguladora (82). La fosforilación de las subunidades β también puede modular la interacción reguladora con las subunidades α formadoras de poros (83). Recientemente se ha demostrado que la regulación de un canal de Kv cardíaco (KvLQT) por cAMP requiere la expresión de AKAP15/18 o AKAP79 (84)., Además, un aumento en Voltaje-dependiente K+ corriente está implicado en la inhibición inducida por epinefrina del aumento dependiente de glucosa en I en ob / ob y + / + ratón β-células (85) ya que el efecto fue invertido por tetraetilamonio. Curiosamente, el efecto inhibitorio de la epinefrina en I también fue revertido por el activador de la adenilil ciclasa forskolina (85). Por lo tanto, creemos que hay evidencia creciente que sugiere que la modulación hormonal de las corrientes Kv es fisiológicamente importante. Específicamente, se espera que la inhibición de GLP-1 de estas corrientes conduzca a una mayor excitabilidad de las células β.,
GLP – 1 y otros canales iónicos de células β.
Los aumentos en el cAMP intracelular han sido conocidos por mejorar las corrientes de Na+ (86), un efecto que puede ser mediado a través de la fosforilación de canal directo por PKA (87). Una respuesta transitoria de Na+ corriente a cAMP se describió por primera vez en las neuronas gasterópodos y se denominó INa(cAMP) (88)., En células secretoras de insulina, la expresión de ARN de los genes catiónicos no selectivos mSTRPC4 y ltrpc2 se ha detectado recientemente en células de insulinoma e islotes humanos, respectivamente (89), y se ha informado que cAMP induce la expresión génica de mNSC1, que codifica un canal catiónico inespecífico (NSCC) de ratón (90). Se cree que el GLP-1 Mejora un NSCC que lleva predominantemente corrientes Na+ (91,92). Este efecto ocurre a través de la activación de GLP-1 de la señalización de cAMP y la liberación de reservas intracelulares de Ca2+ y puede servir como otra vía moduladora importante para GLP-1 en la célula β (40)., No está claro si los NSCC activados por GLP-1 corresponden a la corriente catiónica no selectiva producida por la activación del receptor de detección de Ca2+(93), pero se informa que este último efecto no implica la activación de la subunidad Gs y, por lo tanto, no puede involucrar la vía cAMP/PKA.
se sabe poco sobre los efectos del GLP – 1 en otros canales iónicos. Se han detectado Corrientes Cl activadas por hinchazón celular en células secretoras de insulina (94), pero no está claro el papel de estos canales en la secreción de insulina., Los canales Cl como el regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística y los canales Cl rectificadores externos se activan mediante la señalización cAMP / PKA (95). Si ocurre en la célula β, este efecto tendería a promover la despolarización. Un informe sugiere que GLP-1 activa una corriente Cl sensible a Ca2+en ovocitos Xenopus que expresan el receptor GLP− 1 (96), un efecto que fue dependiente de ins(1,4,5)P3-dependiente de la movilización intracelular de Ca2+ (96). Queda por determinar, sin embargo, si el GLP-1 puede estimular las corrientes de Cl en las células secretoras de insulina.
GLP – 1 y exocitosis.,
la glucosa puede ejercer un efecto estimulante sobre la exocitosis de insulina, independientemente de sus acciones bien caracterizadas iniciadas por la inhibición de los canales KATP. La importancia de esta vía en parte se puede dar cuenta por el hecho de que los ratones con una interrupción dirigida en KATP (Kir 6.2 o SUR1) no muestran anormalidades manifiestas en la tolerancia a la glucosa (97,98). La secreción de insulina independiente de KATP no se entiende bien y se cree que involucra varias señales que actúan sobre objetivos no iónicos, en particular los pasos distales de la exocitosis., Se ha propuesto que el metabolismo de la glucosa es necesario para este efecto estimulante y que las señales probables incluyen ATP, cAMP, glutamato y malonil-CoA (Rev.in 99 y 100). Dado que el ATP, cAMP y PKA están implicados en el proceso exocitótico, es plausible pensar que el GLP-1 puede tener efectos distales a las acciones en los canales iónicos, aumentando aún más la secreción de insulina. Es bien sabido que las acciones que suprimen la acumulación de cAMP inducida por GLP-1 y la activación de PKA inhiben la secreción de insulina, lo que sugiere que cAMP y/o PKA son los efectores plausibles (101)., En las células β del ratón, solo una fracción de la exocitosis puede explicarse por las acciones en el acoplamiento estímulo-secreción (102). A partir de estudios que muestran que el cAMP induce secreción en presencia de I bajo y alto, se sugiere que el cAMP sensibiliza la maquinaria exocitótica. Los estudios que utilizan inhibidores fotoreleables de cAMP y PKA demuestran que cAMP evoca efectos dependientes e independientes de PKA sobre la exocitosis. Los aumentos en el cAMP, independientemente de la activación de la PKA, parecen acelerar la exocitosis del grupo fácilmente liberable en las células β (103)., La movilización dependiente de PKA de gránulos secretores, a diferencia de la generación de cAMP en sí, parece requerir el metabolismo de la glucosa (aumento de ATP/ADP) e implica la translocación de gránulos (103,104). Tal efecto aumentaría el tamaño de la piscina fácilmente liberable, aumentaría la tasa de reposición de la piscina y mejoraría la exocitosis. Debido a que el GLP-1 puede aumentar tanto la AMPc como la PKA, estos datos pueden implicar efectos sobre la exocitosis., Hay varias proteínas diana potenciales para las acciones de GLP-1, incluyendo las proteínas del receptor de proteína de unión del factor sensible a la N-etilmaleimida soluble en células β (SNARE) (105).
GLP-1 y homeostasis de energía intracelular.
estudios recientes en células β clonales sugieren que las acciones insulinotrópicas de GLP-1 están en parte mediadas por una estimulación dependiente de PKA de lipasa sensible a hormonas (HSL) (106). Se propone que las acciones lipolíticas del GLP-1 causan la descomposición de los triglicéridos en ácidos grasos libres en las células β, que luego se convierten en CoA de cadena larga., Un aumento en los ácidos grasos libres podría proporcionar sustrato para la oxidación mitocondrial y la producción de ATP, lo que conduce a un mayor aumento en la relación ATP-ADP intracelular y una mayor inhibición de los canales KATP. Además, debido a que el ATP puede influir en la exocitosis, algunas de las acciones de GLP-1 pueden ser dirigidas a los pasos distales de la exocitosis, como se mencionó anteriormente. Se ha demostrado en varios estudios que el ATP facilita notablemente la exocitosis independiente de la despolarización celular pero que depende de Ca2+ (99)., Por lo tanto, otro mecanismo potencial podría explicar la secreción de insulina inducida por GLP-1.