Havaitseminen Pneumocystis jirovecin aiheuttama Hengitysteiden Näytteet Neljä Värjäys Menetelmiä

Pneumocystis jirovecin, joka tunnettiin aiemmin nimellä Pneumocystis carinii, on edelleen tärkeä syy keuhkokuume immuunivajepotilailla, vaikka infektioita tämä agentti on vähentynyt sen jälkeen, kun laaja käyttö erittäin aktiivinen antiretroviraalinen hoito (HAART) ihmisen immuunikatovirus (HIV) – infektio (9, 12). Potilaat, joilla on immuunivajaus muista syistä kuin HIV-infektiosta, ovat myös vaarassa saada P: n aiheuttaman keuhkokuumeen., jirovecin, mukaan lukien potilaat, joilla on hematologisia syöpiä ja ne, jotka ovat saaneet immunosuppressiivisia aineita hoitoon autoimmuunisairauksien (2, 11, 12).

Vaikka erilaisia nukleiinihappo-vahvistus määritykset, mukaan lukien real-time PCR-määrityksissä, on kehitetty havaitsemiseksi P. jirovecin, nämä määritykset eivät ole arkipäivää useimmissa kliinisissä mikrobiologian laboratorioissa ja eivät ole saatavilla kaupallisesti (3, 5). Sen vuoksi tärkein laboratoriomenetelmä P., jirovecin, organismi, joka voi olla viljelty standardimenetelmiä, on suora visuaalinen tarkastelu kliininen näyte jonkin tyyppinen värjäytyminen menetelmä (12). Erilaisia histokemialliset värjäykset on käytetty havaitsemaan Pneumocystis kliinisissä yksilöitä. Nämä histokemialliset värjäykset ovat Diff-Quik, Lindaman-Gomori metenamiini-hopea (GMS), ja Calcofluor white tahroja. Diff-Quik stain on muunnos Wright stainista (3). GMS-tahra on hopeinen saostustahra, jota käytetään yleisesti sienten visualisointiin histologisissa osissa (10)., Calcofluor white tahra on fluoresoiva tahra, aktiivinen ainesosa, joka on cellufluor, joka nonspecifically sitoutuu beta-sidottu polysakkarideja, kuten kitiini ja selluloosa, ja käytetään suora visualisointi sienten kliinisten näytteiden (4). Immunofluorescent tahroja, jotka työllistävät vasta-aineita suunnattu P. jirovecin, ovat myös saatavilla suora havaitseminen tämän organismin kliinisten näytteiden (3, 5). Nämä tahrat muistuttavat suoria ja epäsuoria immunofluoresenssitahroja, joita käytetään virusten havaitsemiseen kliinisissä näytteissä., Jokaisella tahralla on kannattajansa; HAARTin aikakauden vertailutiedot ovat rajalliset.

näin Ollen, suoritimme multi-institutionaalinen arviointi neljä yleisesti käytetty värjäys menetelmiä, joiden suora havaitseminen P. jirovecin kliinisissä hengitysteiden yksilöitä. Diat hengitysteiden yksilöitä tutkittu, joista suurin osa oli bronchoalveolar huuhtelu näytteet valmistettiin käyttämällä cytocentrifugation. Jäljitellä tahroja 313 hengitysteiden näytteet toimitetaan P. jirovecin tutkimus tutkittiin läsnäolo P. jirovecin kanssa Calcofluor white (Fungifluor; Polysciences, Inc., Warington, Isä.), GMS, Diff-Quik (Baxter Scientific, McGraw Park, Ill.) ja Merifluoripneumocystis (Meridian Bioscience, Inc., Cincinnati, Ohio) tahroja. Diat oli värjätty Merifluoripneumocystis-ja Diff-Quik-tahroilla valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sillä Calcofluor white värjäys, 1 tippa Fungifluor oli lisätä kunkin dian, että peitinlasin oli sovellettu niin, että reagenssi kattoi koko näytteen sisältävä alue, ja liu ’ uta sai istua vähintään 10 min pimeässä kosteus kammiossa huoneenlämmössä ennen tulkintaa fluoresenssi mikroskooppi., Sillä GMS värjäys, diat olivat microwaved 40 s, 10% kromihappo ratkaisu, pestään vedellä, ja sitten tyhjennetään 1% natriummetabisulfiitti 30 s. Jälkeen levyt pestiin tislatulla vedellä, ne pantiin Coplin purkki, joka sisältää 50.0 ml metenamiini toimiva ratkaisu ja microwaved vielä 65 s., Diat olivat huuhdeltava uudelleen tislatulla vedellä, käsiteltiin 1% kultaa kloridi-2 5 s, huuhdellaan tislatulla vedellä, altistuvat 5% natriumtiosulfaatin 1 min, counterstained kevyt vihreä toimiva ratkaisu, selvitetty ksyleeni, peitetty kansi luistaa, ja tutkittava rutiini valomikroskoopilla.

Jokaisen laboratorion neljästä osallistuvien toimielinten suoritetaan yksi eri tahrat ja sulatettu niiden tulkintojen perusteella, että värjäys menetelmä., Yksilöiden kullakin laitoksella oli kokemusta värjäys menetelmä suoritetaan siellä ja tulkinta tahra. Yksilöille annettiin yksilölliset tunnistekoodit, ja jokainen tahra tutkittiin itsenäisesti tietämättä, mikä tulos saatiin toisella värjäysmenetelmällä samasta näytteestä., Määrä näyte oli harvoin riittävästi, jotta kaikki neljä dioja; 308 diat olivat saatavilla värjäys Calcofluor white, 310 diat olivat saatavilla värjäys Merifluor Pneumocystis, 307 diat olivat saatavilla värjäys Diff-Quik, ja 310 diat olivat saatavilla värjäys GMS. Ei mitään tapauksia, jossa dia oli poissa, koska riittämätön määrä näytteen teki luokittelun, että näyte kuin oikea positiivinen tai oikea negatiivinen (ks. alla) riippuvat tulos poissa liukumäki.,

herkkyys, spesifisyys sekä positiiviset ja negatiiviset ennustearvot laskettiin standardimenetelmillä (Taulukko 1). Mittasuhteet tosi-positiivisten ja väärien positiivisten tulosten pariksi testejä verrattiin khiin neliö-testi käyttäen EpiCalc 2000 tilastollinen ohjelmisto (www.brixtonhealth.com/epicalc.html).

Vaikka enemmän totta-positiiviset näytteet olivat havaita Merifluor Pneumocystis tahra, tämä määrä ei ole merkittävästi erilainen kuin havaitse Calcofluor white (P = 0.260) ja GMS (P = 0.343) tahroja., Vastaavasti GMS: n ja Kalkofluorivalkoisten tahrojen havaitsemien todellisten positiivisten määrä ei eronnut merkittävästi toisistaan (P = 0,838). Määrä todellisen positiivisia havaita Diff-Quik tahra oli kuitenkin huomattavasti vähemmän kuin niitä havaitse Merifluor Pneumocystis (P = 0,002), GMS (P = 0.027), ja Calcofluor white (P = 0.042) tahroja. Määrä vääriä positiivisia ei merkittävästi eroa Calcofluor white, GMS, ja Diff-Quik tahrat (kukin vertailu oli P-arvo >0.05)., Määrä vääriä positiivisia raportoitu värjäyksen kanssa Merifluor Pneumocystis tahra oli kuitenkin huomattavasti suurempi kuin ne, joita on raportoitu sen jälkeen, kun värjäys GMS (P = 0,004), Calcofluor white (P = 0,001) tai Diff-Quik (P = 0,001).

joissakin tapauksissa, on indusoitu yskös näyte voi olla ensimmäinen näyte saadut arviointi läsnäolo Pneumocystis diagnostinen workup potilaan keuhkokuume epäillään johtuvan tämän organismin (6)., Jos indusoitu yskös näyte ei tuota etiologic agentti keuhkokuume, sitten näyte bronchoalveolar huuhtelu, joka on huomattavasti kalliimpaa ja ei kantaa pienen riskin potilas, voi olla tarpeen saada diagnostinen materiaali., Koska erot hoidossa Pneumocystis vs. aiheuttama keuhkokuume muu mikro-organismeja ja mahdollinen tarve bronkoskopia, joka aiheutuu ylimääräisiä kustannuksia ja riskejä potilaalle, mikäli diagnoosi ei ole vahvistettu, on tärkeää, että paras mahdollinen värjäys menetelmää voidaan käyttää tunnistus, tämän organismin.,

sen Lisäksi, että on tärkeää herkkä ja spesifinen värjäytyminen menetelmä aikakaudella HAART-hoitoa, on erityisen tärkeää, koska pienempi esiintyvyys Pneumocystis vaikuttaa haitallisesti positiivinen ennustearvo tahansa menetelmällä, joka on spesifisyys vähemmän kuin 100% (9). Vaikka esiintyvyys Pneumocystis on erilainen HAART aikakausi kuin pre-HAART aikakausi, valinta optimaalinen värjäys menetelmä havaitsemiseksi Pneumocystis on myös tärkeää, että potilaat, joilla on muita immunocompromising ehtoja, jotka ovat vaarassa infektio., Itse asiassa, valinta optimaalinen värjäys menetelmä voi olla enemmän tärkeää, että havaitseminen Pneumocystis non-HIV-tartunnan, immuunipuutteisten potilaiden, koska se on osoitettu, että hengitysteiden yksilöitä alkaen näiden potilaiden on pienempi taakka organismit kuin ne, HIV-tartunnan, immuunipuutteiset potilaat (6).

– meidän kokemus, Diff-Quik tahra ei ole tehokas keino seulonta läsnäolo P. jirovecin (eli ensisijainen värjäys menetelmä), koska alhainen herkkyys ja negatiivinen ennustearvo tämä tahra. Huomattavasti enemmän yksilöitä, jotka sisälsivät P., jiroveci jäi paitsi Diff-Quik-menetelmällä kuin Kalkofluorivalkoisella, Merifluoripneumocystis-ja GMS-Valmisteella. Raab ym. on myös kuvata sekä alhainen herkkyys (68%) ja matala spesifisyys (88%), kun Diff-Quik tahra yksin oli käytetty havaitsemiseksi Pneumocystis ja muita sieniä bronchoalveolar huuhtelu näytteet (10). Nämä havainnot ovat kuitenkin toisin kuin muut ryhmät, jotka ovat ilmoittaneet, että Diff-Quik menetelmä oli verrattavissa GMS värjäys menetelmä havaitsemiseksi Pneumocystis (7, 8)., Yksi ryhmä kertoi, että Diff-Quik menetelmä on herkempi kuin Calcofluor white, suora immunofluorescent värjäystä, ja jopa PCR, mutta näitä tuloksia ei ole vahvistanut (1).

Toisaalta, Merifluor Pneumocystis tahra oli herkin menetelmä värjäys ja voi osoittautua hyödylliseksi, sillä näytön sulkea pois läsnäolo Pneumocystis, mutta se oli ainakin erityinen menetelmä tässä tutkimuksessa. Kuitenkin, määrä vääriä positiivisia tuloksia Merifluor Pneumocystis tahra oli huomattavasti suurempi kuin raportoitu kunkin muut tahrat., Se Merifluor Pneumocystis tahra oli positiivinen ennustearvo vain 81.9%, verrattuna muihin kolme menetelmiä, jotka kaikki oli positiivinen ennustearvo oli suurempi kuin 96%. Ng ym. ovat myös kuvanneet näennäisen vääriä positiivisia tuloksia tällä värjäysmenetelmällä (8). Siksi ehdotamme, että jos Merifluor Pneumocystis käytetään ensisijaisena värjäys menetelmä kliinisessä mikrobiologian laboratoriossa, sitten vahvistuksen, jossa on toinen tapa olisi suoritettava lisätä spesifisyys ja positiivinen ennustearvo testin lopputulos.,

herkkyydet sekä Calcofluor white-ja GMS-tahrat olivat välimuoto ne Diff-Quik ja Merifluor Pneumocystis tahroja, mutta ne olivat hyvin erityisiä ja oli positiivinen ennustearvo oli yli 96% ja negatiivinen ennustearvo oli yli 93%. Fraire ym. ovat myös kuvailleet Kalkofluorivalkoisen ja GMS-tahrojen olevan verrattavissa Pneumocystisin havaitsemiseen 92,6-prosenttisella konkordanssilla (4). Baughman ym., (1 a) kuvata myös herkkyys epäsuora immunofluorescent vasta tahra, joka on suunnattu kohti Pneumocystis ja ylivoimainen herkkyys verrattuna muutettu Wrightin tahra ja GMS tahra, mutta he kertoivat yhden väärän positiivisen tuloksen ja näin ollen paljon suurempi spesifisyys kuin kuvaamme. On mahdollista, että ylimääräisiä käytäntö, yksi voi helpommin tunnistaa pathognomonic lomakkeet Diff-Quik tahra, mikä nostaa herkkyyttä, että määritys., Samoin, ehkä ylimääräisiä kokemusta Merifluor Pneumocystis tahra, yksi voisi oppia paremmin erottamaan tosi-positiivisten ja väärien positiivisten värjäys ja siten vähentää määrä vääriä positiivisia tuloksia.

kokemuksemme mukaan Kalkofluorivalkoiset ja GMS-tahrat ovat parhaat parametrit rutiinikäyttöön kliinisessä laboratoriossa. Vaikka nämä määritykset eivät olleet yhtä herkkiä kuin immunofluoresenssimääritys, ne olivat hyvin spesifisiä ja niillä oli enemmän kuin hyväksyttäviä positiivisia ja negatiivisia ennustavia arvoja.,

• Copyright © 2004 American Society for Microbiology