PCR on tekniikka modernin molekyylibiologian laboratorioissa. Jos sinun täytyy kopioida, sekvenssi tai kvantifioida DNA , sinun täytyy tietää PCR. Lyhyesti sanottuna, PCR (polymeraasiketjureaktio) on biokemiallinen tekniikka, joka käyttää thermocycling ja entsyymejä, nopeasti ja luotettavasti kopioida DNA: ta, ja se keksittiin vuonna flash inspiraation tiedemies ajo Valtatie 128 San Francisco Mendocino.,
Tämä artikkeli antaa lyhyt, perus katsaus PCR, jossa on muutamia vinkkejä, joiden avulla voit välttää yleisimmät sudenkuopat. Jos olet uusi, tai suhteellisen uusi PCR sitten tämä on sinulle. (Ja vaikka olet kokenut PCR se kannattaa lukea virkistää, ja ehkä napata kärki tai kaksi!).
Perus-PCR Ainekset:
Polymeraasi
– Polymerases ovat entsyymejä, jotka oikeissa olosuhteissa, voi koota uusi osa DNA-malli DNA: n ja nukleotidien. Alkuperäinen PCR-reaktio oli hankalaa, koska korkeat lämpötilat tarvitaan denaturoida DNA tappaisi polymerases., Tämä tarkoitti sitä, että jokaisen lämmityskierron jälkeen reaktioon piti lisätä käsin uusia polymeraaseja– kallis yritys. Kuitenkin nyky-PCR-tämä ei ole ongelma, koska polymeraaseja käytetään nykyaikaisia PCR tulevat yleensä yksi kaksi termofiilisten bakteerien lähteitä, Thermus aquaticus tai Pyrococcus furiosus. Nämä polymerases, vastaavasti, Taq (lausutaan ”tack”) ja Pfu (lausutaan ”P-F-U”) helposti kestää korkeita lämpötiloja liittyy PCR-reaktio., Kaupallinen Taq ja Pfu-polymeraaseja on suunniteltu nopeus, tarkkuus, processivity (kyky suorittaa pitkään lukee), ja niiden kyky lukea GC-rikas malleja. Yritykset saavat jatkuvasti uusia polymeraaseja. Siksi, älä tyydy ”mikä on pakastimessa”, mutta ostoksia noin paras kaupallinen polymeraasi oman PCR tarvitsee. Keskustele myös paikallisen myyntiedustajan kanssa, koska he voivat usein antaa ilmaisia polymeraasinäytteitä, joten voit päättää, mikä on sinulle parasta.
Template DNA
Tämä on DNA, johon suunnittelet alukkeet., Polymeraasi lukee ja kopioi DNA: ta. Mallin DNA voi olla genominen, plasmidi tai cDNA, mutta riippumatta lähde laatu ratkaisee. Mitä ehompi ja puhtaampi malli DNA, sitä helpompi on saada hyviä PCR-tuloksia. Muista myös, että ihanteellinen määrä DNA riippuu lähteestä, yleensä 1 pg – 1 ng plasmidin DNA tai 1 ng – 1 µg genomin DNA per PCR-reaktio.
alkuluvut
alkuluvut ovat lyhyitä syntetisoidun DNA: n fragmentteja, jotka sitoutuvat mallin DNA: han. Sinun täytyy suunnitella yksi ”eteenpäin” primer ja yksi ”käänteinen” primer., Forward primer tarkoittaa PCR: n alkua. Tämän primerin sekvenssi on sama kuin 5-3 mallin DNA-sekvenssi. Reverse primer määrittää PCR: n pään. Tämä pohjustusvoide on DNA: n käänteinen komplementti. Alukkeet ovat yleensä 18-22 emäsparia pitkiä. Niiden pituutta tärkeämpää on kuitenkin pohjustustesi sulamislämpötila. Pohjamaalien sulamislämpötilan tulisi olla 54-60°C ja mahdollisimman samanlainen kuin toistensa., On olemassa paljon online-laskimia, jotka voivat laskea primer hehkutus lämpötilat, ja useimmat yritykset, jotka syntetisoivat pohjamaalit toimittaa tällaisia laskimia.
nukleotidit
DNA: n monomeereina nukleotidit ovat välttämättömiä DNA-kopioiden tekemisessä. Useimmissa DNA-PCR: issä käytetään Deoksinukleosiditrifosfaatteja (dNTPs). Voit ostaa nämä erikseen tai dGTP, dCTP, dATP ja dTTP sekoitus. Mitä ostat, mutta, pitää mielessä, että nukleotidit ovat hyvin herkkiä jäädyttää/sulattaa syklit. Siksi on parasta aina luoda pieniä näytteitä teidän dNTPs., Varmista myös, että säilytät ne oikein-älä käytä pakkasettomaa pakastinta, joka käy läpi automaattiset sulatusjaksot.
Puskuri
useimmat kaupalliset polymeraasit tulevat ideaalipuskurinsa mukana. Näitä puskureita ei vain toimittaa oikea pH, mutta he aina ovat lisäaineita, kuten magnesiumia, kaliumia, tai DMSO, joka auttaa optimoimaan DNA: denaturointi, renaturing, ja polymeraasin toimintaa. Näistä lisäaineista kerrotaan lisää tulevassa artikkelissa.
Thermocycling:
This is where the magic happens., Kaikki edellä mainitut ainesosat lisätään PCR-putkeen ja putki termosyklataan. Termosyklauksen aikaansaamiseksi PCR: n keksiessä ensimmäisen kerran yksittäisiä PCR-putkia siirrettiin käsin lämmitettyjen vesikylpyjen välillä. (Ja sinusta penkkityösi on työlästä!) Nyt, kiitos keksinnön ”Mr. Cycles”, ensimmäinen thermocycling kone, lämpötilan säätely tehdään nyt automaattisesti thermocyclers. Seuraavassa on tyypillinen thermocycler PCR-profiili:
Alustus
tässä vaiheessa reaktio on lämmitetty 94-96°C: ssa 30 sekunnin useita minuutteja., Tämä vaihe tehdään yleensä vain kerran PCR-reaktion alussa. Tämä vaihe on tärkeä aktivoitaessa kuuma-start polymeraaseja, jos käytät tällaista polymeraasia, ja denaturoida mallin DNA. Muista, että jos mallisi GC-sisältö on korkea, saatat joutua suorittamaan pitkän alustusvaiheen.
denaturaatio (toistetaan 15-40 kertaa)
tässä vaiheessa reaktiota kuumennetaan 94-98°C: seen 15-30 sekunnin ajan. Tämä vaihe denaturoi DNA: n ja primerit, joiden avulla ne voivat hehkuttaa toisiaan seuraavassa vaiheessa.,
Hehkutus (toistetaan 15-40 kertaa)
tässä vaiheessa, reaktion lämpötila on nopeasti laskea 50-64°C 20-40 sekuntia. Lämpötila tässä vaiheessa on oltava niin alhainen, että denaturoidut pohjamaalit voivat muodostaa Watson-Crick emäspareja mallin DNA: n kanssa. Mutta tarpeeksi korkea, että vain vakaimmat (täysin parilliset) kaksijuovaiset DNA-rakenteet voivat muodostua. Yleensä tämä täydellinen hehkutus lämpötila on muutaman asteen alhaisempi kuin sulamislämpötila sinun alukepari. Myös tämän vaiheen aikana polymeraasi sitoutuu primer / template DNA-kompleksiin., Polymeraasi tosin alkaa lukea vasta, kun lämpötila nousee seuraavassa vaiheessa.
Venymä tai Laajennus (toistetaan 15-40 kertaa)
tässä vaiheessa reaktio on nopeasti lämmitetty 72-80°C. Tämä on, kun polymeraasi alkaa lukeminen (in 5-3 suuntaan) ja kopioimalla malli-DNA: ta (3-5direction). Tämän vaiheen korkeampi lämpötila vähentää epäspesifisiä primer / template DNA-vuorovaikutuksia, mikä lisää reaktiosi spesifisyyttä., Kuitenkin tarkka lämpötila määräytyy etusija oman polymeraasi, joten lue pakkaus. Tämän vaiheen pituus riippuu siitä, kuinka kauan DNA-kopiosi on. Tyypillisesti DNA-polymeraasi voi kopioida 1 000 emäsparia minuutissa. Siksi sinun täytyy sallia vähintään 1 minuutin jatkoaika per 1000 emäkset. Tämän inkubaation lopussa on syntynyt uusia kaksijuosteisia DNA-kappaleita, jotka koostuvat sekä mallista että uudesta DNA: sta.
vaihe 2-4 toistetaan tämän jälkeen 15-40 kertaa
on totta, että mitä useampia syklejä ohjelmoit, sitä enemmän luot DNA-kopioita., Yläraja on kuitenkin olemassa. Jossain vaiheessa vapaat nukleotidit tulevat rajoittaviksi ja ennenaikaisesti typistetyt DNA-kopiot voivat muodostua ongelmaksi. Älä siis ahnehdi pyöräilyäsi. Vähemmän mutta hyvä puhdas PCR-tuote on parempi kuin paljon likaista tuotetta.
lopullinen venymä
Tämä on valinnainen, mutta usein suositeltu vaihe. Tässä vaiheessa reaktiota pidetään 70-74°C: ssa useita minuutteja. (Yleensä käytät samaa lämpötilaa kuin venymä-tai laajennusvaiheessa.) Tämän vaiheen avulla polymeraasit voivat lopettaa lukemisen riippumatta juosteesta, jolla ne ovat tällä hetkellä., Tämä valinnainen vaihe voi auttaa vähentämään typistettyjen kopioiden määrää lopullisessa tuotteessasi.
Final hold
reaktiosi on nyt valmis. Koska koko prosessi voi kestää muutaman tunnin, PCR-reaktioita tehdään usein yön yli tai kun olet muuten astui pois; on suositeltavaa, että voit ohjelma teidän thermocycler pitämään PCR-tuote, 4°C, kunnes palaat. Silloin voit analysoida tai käyttää tuotettasi tai siirtää sen sopivaan pitkäaikaiseen säilytykseen, kuten jääkaappiisi.
onnea ja onnea PCR-ing!
onko tämä auttanut sinua?, Jaa sitten verkkosi kanssa.