”RNA-sekvensointi on korkea suoritusteho seuraavan sukupolven sekvensointi käytetty menetelmä analysoida geenien ilmentyminen ja transcriptomics tutkimukset.”
ribonukleiinihappo on tyyppi nukleiinihapon aikuinen mukana geeniekspression, geenien säätelymekanismit ja koodaus/dekoodaus tiedot.
mRNA – lähetti-RNA on koodaus järjestyksessä geeni mukana synteesissä proteiini, noin 4% RNA-allas koostuu mRNA kun taas loput ovat non-coding RNAs.,
Vaikka noin 90% RNA: n ei-koodaava, ne ovat tärkeitä suorittaa erilaisia toimintoja.
esimerkiksi
- tRNA – siirrot aminohappo ribosomin kohdeyksikön muuttuminen, sivusto, kun taas käännös.
- rRNA – ribosomaalinen RNA auttaa kääntämisessä.
- mikroRNA – geenin ilmentymä ja geeniekspression säätely.
- siRNA – suojaa solun ulkoisten RNAs.
mRNA on yksijuosteinen nukleiinihappo puhtaaksi geenistä ja josta proteiini on käännetty.,
mRNA eli transkripti sisältää vain koodaussekvenssit geenistä. Siten sillä on vain sekvenssit, joita tarvitaan proteiinin muodostumisessa.
vastedes mRNA: ta analysoimalla voidaan määrittää siihen liittyvän geenin ilmentymäkuvio.
Myös, kokonais-RNA-tutkimus antaa meille käsityksen siitä, mitkä geenit ovat yhteydessä proteiinin muodostumista ja mitkä eivät.
tarkoittaa, kokonais-RNA: n, mRNA: n ja ncRNA: n määrä voidaan määrittää tutkimalla kokonais-RNA: ta.,
Transcriptomics on tutkimuksen koko mRNA – usein kutsutaan transcriptomes tai total RNA läsnä solu tai soluryhmä.
analysoimalla solun transkriptomia voidaan tutkia koko geenin ilmentymän pooli. Yksi tärkeistä transcriptomics-tutkimuksissa käytetyistä tekniikoista on RNA-sekvensointi.
organismin transkriptomi on genomista poiketen suurempi, kompleksinen ja epävarmempi.
transcriptome vaihtelee eri tilassa ja eri ympäristössä., Elämäntapa, ruokavalio, liikunta, ympäristö, sääolosuhteet ja muut ulkoiset tekijät ovat merkittävässä roolissa transcriptome asetuksen.
Täällä RNA-sekvensointi, että syntetisoitu cDNA päässä mRNA on sekvensoitiin ja määrällisesti sekvensseri. Tässä artikkelissa käsittelemme vain RNA-sekvensointia, mutta sitä ennen luemme edellisen kirjoituksemme transkriptomiikasta: mikä on Transkriptomiikka?,
Aiheet:
Periaate RNA-sekvensointi:
RNA-sekvensointi on seuraavan sukupolven, korkea suoritusteho RNA-sekvensointi ja määrällistä menetelmää käytetään tutkittaessa transcriptomics ja geenien ilmentyminen.
cDNA rakentuu kokonaismomrna: sta käänteisen transkription ja sirpaloitumisen kautta. Simultaanisidontaa ja kirjastojen valmistelua harjoitetaan ennen jaksottamista.
sekvensseri lukee ja kvantifioi mRNA: ta täydentävän cDNA: n.,
Steps in RNA-seq:
- RNA isolation
- cDNA synthesis
- Adaptor ligation
- Library preparation
- DNA fragmentation
- Sequencing
- Downstream applications
RNA isolation:
The first step in the RNA sequencing is the isolation of total RNA, mRNA or ncRNA for the experiment.,
RNA: n eristäminen on ikävä prosessi DNA: n eristämiseen verrattuna. RNA voi hajota helposti. Myös RNA-eristyksessä kontaminaation mahdollisuus on suuri.
siksi RNA: ta eristettäessä on noudatettava erityistä varovaisuutta ja asiantuntijakäden on oltava sitä varten tarpeen.
korkean tuotoksen puhdasta RNA: ta tarvitaan RNA: n sekvensointiin.
RNA: n puhtaus ja määrä mitataan Nanodropilla tai kvitillä.
Note: for isolating mRNA from the total RNA pool, one additional step is required, using the oligo dT specific column in the purification or final step of elution, total mRNA can be isolated from the rest of RNAs.
– Nyt meidän RNA-näyte on valmis seuraavaan vaiheeseen.,
käänteiskopioijaentsyymi-PCR:
Toinen innovatiivinen perustettu RNA-sekvensointi on tehdä käänteiskopioijaentsyymi-PCR, jossa RNA on käänteinen puhtaaksi osaksi DNA: ta.
DNA-käänteiskopioijaentsyyminä tunnetun polymeraasin avulla cDNA syntetisoidaan mRNA: sta.
Lue lisää RT-PCR täällä: käänteiskopioijaentsyymi-PCR.
Second strand cDNA synthesis:
mRNA: sta syntetisoidun cDNA: n jälkeen tarvitaan toisen Strandin DNA-synteesi. Tätä varten PCR suoritetaan tavanomaisessa PCR: ssä tavanomaisella Taq-DNA-polymeraasilla.,
polymeraasi lisää dntps: n kasvavaan DNA-juosteeseen primer-setin avulla.
Kirjasto valmistelu:
ensimmäinen askel kirjastossa valmistelu tai NGS library preparation alkaa osasia.
Käyttäen erityinen restriktioentsyymien koko joukko ds ekspressio on hajanainen, jotta NGS.
Huomautus:
kirjaston valmistelu vaihtelee alustan alustoilla kuten jotkut fragmentit mRNA ennen kuin suoritat käänteiskopioijaentsyymin kun taas jotkut tehdä sen myöhemmin, kun valmistelu ekspressio.,
kirjaston valmistelun viimeisessä vaiheessa päät sidotaan sovitinsarjojen kanssa ja täydennetään päiden korjaamista varten. dA-tailing on valinnainen tapauksessa mRNA kirjasto.
kirjaston puhdistus:
koko kirjasto puhdistetaan käyttövalmiilla DNA-puhdistuspakkauksella.
viimeisessä vaiheessa, se on erittäin tärkeää puhdistaa koko fragmentti kirjastoon, että pitoisuus kirjasto on arvioitu käyttäen kvantitatiivista PCR-tai bioanalyzer.,
Huomautus:
aloittelija luulen, kirjasto valmistus ja DNA: n hajanaisuus on hyvin vaikea ymmärtää, joten uskomme, meidän pitäisi kirjoittaa koko artikkeli Genomista DNA: n hajanaisuus, kirjasto valmistelu ja sen merkitys NGS.
joka Tapauksessa mennään eteenpäin,
seuraava askel, näyte hajanainen DNA on lähetti-sekvensointi.
DNA-sekvensointi:
Nyt näyte on sekvensoitu korkea suoritusteho NGS kone, joka lukee järjestyksessä sekä määrällisesti nukleiinihapon samoin.,
cDNA: n sekvensoinnin taustalla oleva kemia riippuu siitä, mitä alustoja käytämme, vaikka yleisesti käytetty menetelmä on fluoresenssikemian käyttö.
sekvensserissä yksittäiset fragmentit ”luetaan” erikseen ja jaksotetaan. Lopulliset tiedot lähetetään bioinformatiikan laboratorioon jälkisekvenssianalyysiä varten.,
Different types of RNA and its function:
| Abbreviation | RNA types | Function |
| mRNA | Messenger RNA | Codes for protein |
| tRNA | Transfer RNA | Transfer amino acid to the site of translation., |
| rRNA | Ribosomal RNA | Catalyse the translation reaction |
| miRNA | microRNA | Gene regulation |
| siRNA | Smaller interfering RNA | Gene regulation and maintaining gene expression. |
| LncRNA | Long non-coding RNA | Transcriptional regulation and epigenetic regulations., |
| snRNA | Small nuclear RNA | Helps in mRNA splicing and related functions |
| snoRNA | Small nucleolar RNA | Helps in RNA nucleotide modification |
| piRNA | Piwi-intercalating RNA | Function in defence against transposon; transposon defence system. |
| scaRNA | Small Cajal body-specific RNA | Also helps in nucleotide modifications (a type of snoRNA)., |
| shRNA | Pieni hiusneula RNA-määrä | Synteettinen RNA-molekyyli auttaa geenisäätelyn ja valvoa geenien ilmentyminen. |
Transcriptome data-analyysi:
Yksi tylsiä työpaikkoja, kuten olemme jo käsitelty edellisessä artikkelissa on transcriptome data-analyysi ja tulosten tulkinta. NGS-tiedot ovat valtavia ja monimutkaisempia.,
suoraan Sanottuna, opetus data-analyysi transcriptomics ei ole mahdollista, yksi olisi pitänyt ottaa hands-on käytännön oppia, silti yritän opettaa sinulle, mikä on seuraava tässä prosessissa.
koneeseen sekvensoidaan erilaisia fragmentteja ja kerätään tietoja. Seuraavassa vaiheessa, joka perustuu reunustavat alueen palasia, ns. ”contings” on järjestetty hankkiutua splice-variantit.
seuraavassa vaiheessa transkriptomia verrataan vertailujaksoon tai voidaan koota de novo.,
lyhyt katsaus koko prosessin RNA-seq.
Koko transcriptome sekvensointi:
koko transcriptome solun tai kudoksen – kaikki RNAs (mRNA, tRNA, rRNA, sncRNA, microRNA ja siRNA) sekvensoidaan ja määrällisesti. Toisin sanoen voidaan sanoa, että sekä romaani että tunnetut transkriptit voidaan sekvensoida.
sen tekemistä varten koko RNA-joukko uutetaan kudosnäytteestä.,
Kohde-RNA-sekvensointi:
geeni-erityisiä, klusterin geenien erityisiä, reitti-erityinen tai sairauteen liittyvien transcriptomes jaksotetaan kohde-spesifisten RNA-sekvensointi.
kohde-RNA-sekvensointi on edullisempaa ja tarkempaa kuin koko transkriptomin sekvensointi. Lisäksi kokeen tekemiseen tarvitaan vähemmän RNA-näytettä.
Pieni RNA-sekvensointi:
Yksi kehittyvien tekniikka RNA-sekvensointi on tutkia pienempi kuin koodaavien RNA solun, koska ne liittyvät niin monia toimintoja genomin.,
Pienten RNA-molekyylien, kuten miRNA, siRNA ja pirnan voidaan mitata ja sekvensoitiin kautta NGS perustuu RNA: n sekvensointi-menetelmän eri sovelluksia.
mRNA sekvensointi:
sekvenssi koko mRNA-transkriptio käyttäen poly(a) – pyrstövalintaa, jota käytetään geeniekspressiotutkimuksissa. Käyttämällä mRNA sekvensointi tunnetaan sekä uusi transkriptiomuutos voidaan havaita.
Edut RNA-sekvensointi:
Yksi keskeinen edut RNA-sekvensointi on ei ole tarvetta ennen sekvenssin tiedot., Koska koko prosessi ei perustu koetin-pohjainen kemia, ennen järjestyksessä tiedot suunnitteluun anturi ei tarvita täällä.
tarkempi ja herkempi geeniekspressiotutkimus voidaan tehdä.
laajempi dynaaminen alue.
vangitse sekä tunnettuja että uusia transkriptioon tehtyjä muutoksia, vaikka sekvenssitietoja ei olisikaan saatavilla.
vaikka vertailusekvenssitietoja ei ole saatavilla, RNA-sekvensointia voidaan soveltaa mihin tahansa lajiin.
Related: Synthetic Genome – Methods, Applications And Challenges.,
Johtopäätös:
Kiistatta voidaan sanoa, että RNA-seq-menetelmä on kehittynyt ja tarkka verrattuna microarray. Myös de novo-mutaatioita voidaan havaita sen avulla.