Solun rivit
HEK 293T-solulinja oli saatu American Type Culture Collection (ATCC CRL-3216). Hiiri hybridooma-solulinjoja KT13 ja KT22 saatiin kehitystutkimukset Hybridooma-Pankki (DSHB). Molemmat solulinjat oli talletettu DSHB, jonka Kazumasa Takeda ja Asako Sugimoto (DSHB hybridooma-tuotteita KT13 ja KT22)., Hiiri hybridooma-solu line 5E4/1F1 oli ystävällisesti Miha Kosmač ja Vladka Čurin Šerbec (University of Ljubljana). HEK 293T-ja hybridooma-soluja kasvatettiin DMEM (Gibco), johon oli 13% FBS (Gibco), 1× Penisilliini/Streptomysiini (Thermo Fisher), ja 1× GlutaMAX (Gibco). Vasta HC-ja LC-sekvenssit yksittäisten hybridomas määritettiin käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktiolla (RT-PCR) ja kapillaari sekvensointi (Eurofins Genomics).,
Cycloheximide hoito ja microsome valmistelu
Kaikki pipetointi vaiheet suoritettiin jäällä ja centrifugations tehtiin 4 °C: ssa käyttäen Eppendorf centrifuge 5810R kanssa kiinteä kulma roottorin F-45-30-11. Proteiini LoBind 1,5 mL sentrifugiputkia (Eppendorf) käytettiin vähentämään solujen tarttumista putkiseiniin. HEK 293T-solut (1 miljoonaa euroa), hiiri hybridooma-solut (1 milj. euroa 5E4, KT13, ja KT22 solut sekoitetaan suhteessa 1:1:1), ARH-77 leukemia solut (ATCC CRL-1621, 1 miljoonaa euroa), tai juuri eristettyyn ihmisen CD19+ B-solujen pre – ja post Td-booster rokotukset näytteet (1.,5 euroa kukin) olivat sekoitettava uudelleen 1 mL: n PBS, jossa 50 µg/mL cycloheximide ja inkuboitiin 10 min pysähtyvän ribosomit liittyvät messenger RNAs (mRNA) on karkea endoplasmakalvosto. Solut pelletoitiin 300 g 10 min 4 °C: ssa ja uudelleen suspendoidun, jonka pipetointi 15× ylös ja alas 120 µL high-density lysis buffer (25 mM HEPES-KOH pH 7.2, 110 mM kaliumasetaatti, 5 mM magnesium asetaatti, 1 mM EGTA, 25% sakkaroosi , 5% glyseroli, 1 mM 1,4-ditiotreitolia, 1× täydellinen EDTA-vapaa proteaasinestäjäsekoitus , 0,1 mg/mL cycloheximide, 0.015% digitonin, ja 400 U/mL RiboLock Rnaasi-inhibiittori )., Cell ja organelle lysis valmistuivat inkuboimalla 10 min jäällä. Jokainen homogenaatti jaettiin kahteen 55 µL näytettä ja siirretään kaksi tuoretta Proteiinia LoBind putket. Putket olivat sentrifugoidaan 600 g 3 min 4 °C pelletti ytimet ja solujen roskia. Yhteensä 40 µL supernatanttia alkaen jokainen putki, joka sisältää kalvo jakeet ja sytosolissa, siirrettiin tuoretta Proteiinia LoBind putket ja sakkaroosin pitoisuus laimennettiin 0,37–0.40 M (12-13% w/w) lisäämällä 40 µL nuclease-free water. Mikrosomit sedimentoitiin sentrifugoimalla 20 800 g 120 min ajan 4 °C: ssa., Sytosolissa sisältävät supernatantit olivat hylättyjä ja kalvo pelletit olivat sekoitettava uudelleen, jonka pipetointi 10× ylös ja alas 85 µL pesupuskuria (25 mM HEPES-KOH pH 7.2, 110 mM kaliumasetaatti, 2,5 mM magnesium asetaatti, 1 mM EGTA, 1 mM 1,4-ditiotreitolia, 1× täydellinen EDTA-vapaa proteaasinestäjäsekoitus, 0,1 mg/mL cycloheximide, 0.004% digitonin, ja 400 U/ml RiboLock Rnaasi-inhibiittori). Mikrosomit sedimentoitiin uudelleen sentrifugoimalla 20 800 g: llä 60 min: n ajan 4 °C: ssa., Supernatantit hylättiin ja microsome pelletit olivat sekoitettava uudelleen 20 µL pesupuskuria ja pidettävä jäissä, kunnes edelleen käyttöä.
Transmission electron microscopy
Näyte näytettä, 3,5 µL sekoitettava uudelleen HEK 293T mikrosomeilla sovellettiin juuri hehku-tyhjä Quantifoil ristikot (Quantifoil, Saksa) peitetään ylimääräinen 2 nm carbon tuki elokuva-ja flash-jäädytetty neste etaani käyttäen Vitrobot mäntä (FEI). Näytteet olivat kuvaamisen on Tecnai Henki transmission electron microscope (FEI) käyttää 120 kV varustettu 2 × 2 k Kotka CCD-kamera (FEI)., Micrographs kirjattiin alle cryo matala-annos olosuhteet 42,000× nimellinen suurennus (pikselin koko on esine mittakaavassa: 5.2 Å/px) soveltamalla defocus − 2 − 4 µm. Tiedonkeruu suoritettiin joko manuaalisesti tai täysin automaattisesti Leginonia käyttäen .
Emulsio RT-PCR-kokoonpano hiirellä hybridooma mikrosomeilla
Me laimennettu 16 µL sekoitettava uudelleen mikrosomeilla sekoitetusta hybridomas 5E4, KT13, ja KT22 184 µL: n RT-PCR master mix sisältää 1× Verso 1-Step RT-PCR master mix (Thermo Scientific), 1× Verso entsyymi mix (Thermo Scientific), 0.,5 µg/µL BSA, 100 µg/mL cycloheximide, ja alukkeet käänteinen transkriptio-ja HC-ja LC-kokoonpano (0,8 µM jokainen pohjamaalit TitA_MID1_IgM_rev ja TitB_MID12_IgK_rev; 0.16 µM jokainen pohjamaalit OE_MHV_fwd ja OE_MKV_fwd). Pohjamaali sekvenssit on esitetty Tiedostojen 1: Kuva S1a. Tuloksena 200 µL vesiliuosta käytettiin muodostamaan vesi-öljy-emulsio, jonka tipoittain lisäksi (13 näytettä, 15 µL 30 s välein) 800 µL öljy vaiheen mukaan Ge et al. (Mineraaliöljy, Sigma M5904, 4,5% Span 80, Sigma S6760, 0.4% Tween 80, Sigma P8074, ja 0.,05% Triton X-100, Sigma T8787) jatkuvan sekoittamisen aikana magneettisekoittimella., Kuusi näytettä, 100 µL kunkin tuloksena emulsio siirrettiin PCR-putket ja alistettiin thermocycling seuraavat edellytykset: käänteinen transkriptio 50 °C: ssa 15 min, RTase inaktivaatio 95 °C: ssa 2 min, sitten neljä denaturaatio 95 °C 20 s, hehkutus rampdown 60 °C 50 °C 50 s ja pidennys 72 °C 1 min, sitten 16 denaturaatio 95 °C 20 s, hehkutus 60 °C: ssa 30 s ja pidennys 72 °C 1 min, jonka jälkeen lopullinen laajennus vaihe 72 °C 5 min., Samanaikaisesti, avoin RT-PCR-kontrolli tehtiin laimentamalla 4 µL sekoitettava uudelleen mikrosomeilla 46 µL: n RT-PCR master mix ja thermocycling reaktio rinnakkain emulsio RT-PCR-menetelmällä. PCR-kokoonpano tuotteita poimittiin emulsio käyttäen isobutanol (2-Metyyli-1-propanoli -, Sigma) ja Zymo-DNA-Puhdas & Rikastamo-5 pakki (Zymo Research) kuten aiemmin on julkaistu . Avoimen PCR-kontrollin tuloksena saatu DNA ja PCR-tuote ladattiin 1,2-prosenttiseen TBE-agaroosigeeliin ja erotettiin 90 V: llä 60 min., Kokoonpano tuotteita 800-950 bp koko oli koko-valita agaroosi geeli ja tuotteet olivat talteen käyttämällä Zymoclean Geeli DNA Recovery kit. Kokoonpanotuotteet eluoitiin 6 mM Tris-Cl pH 8: ssa ja säilytettiin − 20 °C: ssa lisäanalyysiin asti.,
Sisäkkäiset PCR-monistus hiiren hybridooma-kokoonpano tuotteita
sen Jälkeen, kun emulsio kokoonpano reaktio, kokoonpano tuotteet olivat edelleen täydennetty sovittimella pohjamaalit TitA_fwd, 5′ CGT ATC-GCC TCC CTC-GCG-CCA TCA G 3′, ja TitB_rev, 5′ CTA: N ja GCC: n TTG CCA GCC CGC TCA G 3′, käyttäen Phusion high-fidelity DNA-polymeraasi kit (Finnzymes) seuraavat thermocycling ehtoja: alkudenaturaatio 98 °C 30 s, sitten 15 denaturaatio, 98 °C: ssa 7 s ja hehkutus/pidennys 72 °C 30 s, jonka jälkeen lopullinen laajennus vaihe 72 °C 5 min., PCR-tuotteet puhdistettiin kanssa Zymo-DNA-Puhdas & Rikastamo-5 pakki. Pariksi HC-ja LC-kokoonpano tuotteita olivat sitten analysoitiin PCR: llä käyttäen sisäkkäisiä alukkeita erityisiä kolmen eri HC ja kolme eri LC (Lisää tiedosto 1: Kuva S1e) käyttäen Phusion high-fidelity DNA-polymeraasi pakki seuraavat thermocycling ehtoja: alkudenaturaatio 98 °C 30 s, sitten 24 denaturaatio, 98 °C: ssa 7 s ja hehkutus/pidennys 72 °C 30 s, jonka jälkeen lopullinen laajennus vaihe 72 °C 5 min., Sisäkkäiset PCR-tuotteet lastattiin 1,2-prosenttiseen TBE-agaroosigeeliin ja erotettiin 90 V: llä 40 min. Reaaliaikainen sisäkkäisiä PCR määrällisesti ristikontaminaation toteutettiin triplicates samalla sisäkkäisiä alukkeita käyttäen SYBRGreen master mix (Applied Biosystems) on StepOne qPCR cycler (Applied Biosystems) seuraavat thermocycling ehtoja: alkudenaturaatio 95 °C 10 min, jonka jälkeen 40 denaturaatio 95 °C 15 s, hehkutus 56 °C: ssa 30 s ja pidennys 72 °C 45 s., Alkuperäinen runsaus täydennetty kokoonpano tuotteita, on laskettu käyttämällä 2^(-deltaCt) menetelmä ja piirretään kuten baari kaavioita virhe baareja osoittaa keskihajonnan päässä keskiarvosta.
Rokotukset ja CD19+ B-solujen erillään reuna koko verinäytteet
ihmisen perifeerisen veren näytteitä käytetään tässä tutkimuksessa saatiin vuonna.vent Diagnostica GmbH rutiininomaisten diagnostisten toimenpiteiden sivutuotteina. vuonna.,vent Diagnostica GmbH on kirjallinen tietoinen suostumus luovuttajan käyttää sivutuotteiden tutkimukseen ja on eettistä hyväksyntää Freiburg Etiikka Komission Kansainvälisen (FEKI-koodi 011/1763) jakelu näytteitä. Terve proband koki booster-immunisaation tetanustoksoidia (TT)/Diptheria Kurkkumätä (DT) (vain Td-pur®; 20 Kansainvälistä yksikköä TT ja 2 IU DT; Novartis, Basel, Sveitsi)., K2-EDTA-reuna koko verestä peräisin pre-immunisaatio (päivä 0) ja seitsemän päivää post-Td tehosterokotus rokotukset käytettiin eristämään CD19+ B-solut käyttäen CD19 pluriBead Solujen Erottaminen Kit (pluriSelect GmbH, Leipzig, Saksa) valmistajan protokollan. Eristetty CD19+ B-solu pelletti pestiin 1 mL kylmää PBS ja sentrifugoidaan 300 g 10 min 4 °C. Solujen pellettejä vastaa 1,5 miljoonaa B-solujen sekä pre – ja post-immunisaatio näytteitä pidettiin jäissä, kunnes cycloheximide hoito ja microsome valmistelu.,
Emulsio RT-PCR-kokoonpano käyttäen ihmisen B-solu mikrosomeilla
lisäsimme 2 µL laimennetaan mikrosomeilla valmistettu jäädytetty ARH-77 soluja (kuten sisäinen pariliitoksen ohjaus) 26 µL sekoitettava uudelleen mikrosomeilla B-solujen sekä pre – ja post-Td rokotukset, niin että lopullinen osa ARH-77 mikrosomeilla on 0,5% (v/v). Meidän laimennettu 16 µL tämä mikrosomeilla jousitus 184 µL: n RT-PCR master mix sisältää 1× tikka 1-step RT-PCR master puskuri sekoita (Roboklon), 2× dART master entsyymi mix (Roboklon), 0.,5 µg/µL BSA, 100 µg/mL cycloheximide ja alukkeet käänteinen transkriptio (IgM, IgG, ja IgK) ja raskas (VH) ja kevyt ketju (VK) kokoonpano. Pohjamaali sekvenssit ja pitoisuudet RT-PCR master mix on lueteltu Tiedostojen 1: Taulukko S2., Tuloksena 200 µL vesiliuosta käytettiin muodostamaan vesi-öljy-emulsio, jonka tipoittain lisäksi (13 näytettä, 15 µL 30 s välein) 800 µL öljy vaihe koostuu 73% emulsio komponentti 1, 7% emulsio, komponentti 2, ja 20% emulsio osa 3 Micellula DNA-emulsio ja puhdistus kit (Roboklon) aikana jatkuvasti sekoittaen magneettisekoittimelle., Kuusi näytettä, 100 µL kunkin tuloksena emulsio siirrettiin PCR-putket ja alistettiin thermocycling seuraavat edellytykset: Käänteinen transkriptio 55 °C: ssa 30 min alkudenaturaatio 95 °C: ssa 3 min., sitten kolme denaturaatio 95 °C 20 s, hehkutus 56 °C: ssa 30 s ja pidennys 72 °C 2 min, sitten 20 denaturaatio 95 °C 20 s, hehkutus 56 °C: ssa 30 s ja pidennys 72 °C 4 min, jonka jälkeen lopullinen laajennus vaihe 72 °C 5 min., PCR-kokoonpano tuotteita poimittiin emulsio käyttäen isobutanol (2-Metyyli-1-propanoli -, Sigma) ja Zymo-DNA-Puhdas & Rikastamo-5 pakki (Zymo Research) kuten aiemmin on julkaistu . Tuloksena Pidettiin lastattiin 1% TBE-agaroosia geeli ja erotettu 100 V 45 min. Kokoonpano tuotteita 700-800 bp oli koko-valita agaroosi geeli, talteen käyttämällä Zymoclean Geeli DNA Recovery kit, eluoidaan 6 mM Tris-Cl pH 8, ja säilytetään − 20 °C ennen analysointia.,
Sisäkkäiset PCR-monistus ihmisen B-solu kokoonpano tuotteita
erityisiä edelleen vahvistusta HC-LC-kokoonpano tuotteita, sisäkkäisiä PCR-monistus suoritettiin sisäkkäisiä alukkeita spesifinen IgM -, IgG-ja IGK jatkuva alueilla (Lisää tiedosto 1: Taulukko S2). PCR-reaktio sisälsi sisäkkäisiä alukkeita 0,4 µM: n pitoisuuksina, 200 µM dNTP mix, 1 x Q5 reaktio puskuri ja 0,02 U/µL Q5 high-fidelity DNA-Polymeraasi (New England Biolabs) reaktion tilavuus 50 µL 3 µL koottu DNA: ta., Sisäkkäisiä PCR-monistus suoritettiin seuraavat thermocycling ehtoja: alkudenaturaatio 98 °C: ssa 3 min., sitten 34 denaturaatio, 98 °C 30 s ja hehkutus/laajennus 71 °C 1 min, jonka jälkeen lopullinen laajennus vaihe 72 °C 5 min. Näytteitä kerättiin kolmen eri PCR-syklin numeron (28, 31 ja 34 syklin) jälkeen. Monistetut PCR-tuotteet ladattiin 1% TBE-agarose-geeleihin ja erotettiin 100 V: llä 60 min., Haluamasi tuotteet ~ 710 bp uutettiin kuten edellä on kuvattu, sekvensointi kirjastot olivat valmiita seuraavat Illumina TruSeq DNA-näytteen valmistelu opas ja 2 × 250 base pariksi-end lukee sekvensoitiin käyttäen Illumina MiSeq-alustan.
Bioinformatiikka-analyysi pariksi vasta raskaan ja kevyen ketjun valikoimia
Demultiplexing 2 × 250 base pariksi-end lukee MiSeq sekvensointialustamme suoritettiin perustuu adapter indeksit ja sekvensointi tietoja saatiin fastq-formaatissa., Lukee vain pienellä Phred laatupisteet 10 yli 50% kaikista nukleotidien olivat kertyneet ja skannattu IgM -, IgG-ja IgK jatkuva alueen sekvenssit. Lue paria puuttuu jatkuva alueen sekvenssit tai osoittaa HC-HC tai LC-LC-rakenne oli suodatettu pois ja loput lukee muunnettiin fastq-muodossa ja käyttää tulo-analyysi MiXCR (v1.2) linjaus lukee viite V(D)J-ja C-geenien sekvenssit IMGT tietokanta -, louhinta -, ja klusterointi CDR-H3 nukleotidin (Lisää tiedosto 1: Taulukko S1)., HC-CDR3-sekvenssit sisältävät frameshifts tai stop kodonien ja vähemmän kuin kaksi lukee oli suodatettu pois. Loimme HC-LC pairing statistics-tiedoston osoittamaan paritettua VH-VK-geenien käyttöä HC-LC-geenirepertuaarien kokonaismäärässä. Lämpökartat laadittiin käyttäen R: ää ja graafisesti ggplot2: ta. Seuraavaksi inter-yksittäisten TT-erityisiä HC-CDR3 sekvenssit määritettiin vertaamalla HC-CDR3 aminohappo-sekvenssit saatu post-Td tehosterokotus rokotukset näyte aiemmin todettu, TT-erityisiä HC-CDR3-sekvenssit .,
PCR-monistus täyspitkän HC-ja LC-sekvenssit
– Meillä on suunniteltu kaksi-vaihe PCR-pohjainen monistus-menetelmä (Lisää tiedosto 1: Kuva S5) sisällyttää rajoitus ruoansulatusta sivustoja mahdollisesti TT-erityisiä HC-ja LC-täydellinen V(D)J-geenin sekvenssi. Tämä mahdollisti HC-ja LC-sekvenssien tehokkaan kloonauksen vastaaviin ekspressiovektoreihin sekä rekombinanttien vasta-aineiden tuotannon in vitro-sitontatutkimuksissa., Lyhyesti, olemme valinneet 14 pariksi HC-LC CDR3 clonotypes saatu IgG-sekvensointi post-Td tehosterokotus rokotukset perustuu niiden taajuus, pariksi tarkkuus, ja taita ero top1 LC-CDR3 ja top2 LC-CDR3 pariksi tietyn HC-CDR3 järjestyksessä. Olemme uuttaa total RNA jäädytetty B-solujen eristetty post-Td tehosterokotus rokotukset käyttäen TRIzol-reagenssia (Ambion) puhdistus mukaan valmistajan ohjeita. Ensimmäisessä vaiheessa, RT-PCR-monistus kunkin valitun HC – ja LC-CDR3 clonotype tehtiin erikseen käyttäen dART 1-step RT-PCR kit (Roboklon)., RT-PCR master mix (25 µL) sisälsi HC-ja LC-V geeni-erityisiä eteenpäin alukkeiden kanssa BssHII rajoitus sivuston ulokkeita yhdessä yksittäisten CDR3-erityisiä reverse-alukkeiden kanssa 18 nukleotidien FR4-alueella 0,4 µM pitoisuudet (Lisää tiedosto 1: Taulukko S3 ja Kuva S5), 1× tikka 1-step RT-PCR master puskuri sekoitus, 1 x dART master-entsyymiseosta, ja 4,5 ng kokonais-RNA: ta., Thermocycling olosuhteet olivat seuraavat: käänteinen transkriptio 55 °C: ssa 30 min alkudenaturaatio 95 °C 3 min, sitten 23 denaturaatio 95 °C 20 s, hehkutus 56 °C: ssa 30 s ja pidennys 72 °C 90 s, jonka jälkeen lopullinen laajennus vaihe 72 °C 5 min. RT-PCR-tuotteet puhdistettiin käyttäen Agencourt AMPure XP – PCR-puhdistus kit (Beckman Coulter) valmistajan ohjeiden ja eluoidaan 6 mM Tris-Cl pH 8.0., Toisessa vaiheessa PCR-vahvistuksen mallina käytettiin puhdistettuja RT-PCR-tuotteita käyttäen Q5-hifi – DNA-polymeraasia (New England Biolabs). Sisäkkäiset PCR master mix (50 µL) sisälsi eteenpäin pohjamaalit koodaus BssHII rajoitus päällä ja kolme nukleotidien HC tai LC ituradan geeni järjestyksessä yhdessä reverse-alukkeet sisältävät täydellinen FR4 alueella ja NheI/HindIII rajoitus ulokkeita 0,4-µM pitoisuudet (Lisää tiedosto 1: Taulukko S3 ja Kuva S5), 4 µL puhdistettua DNA: ta, 200 µM dNTP mix, 1 x Q5 reaktio puskuri, ja 0.,02 U / µL Q5 hifi – DNA-polymeraasi (New England Biolabs). Thermocycling olosuhteet olivat seuraavat: alkudenaturaatio 98 °C: ssa 3 min., sitten 16 denaturaatio, 98 °C 30 s, hehkutus-69 °C: ssa 30 s ja pidennys 72 °C 1 min, jonka jälkeen lopullinen laajennus vaihe 72 °C 5 min. PCR-tuotteet olivat erotettu TBE-agaroosia geeli, täyspitkä HC-ja LC amplicons kanssa rajoitus ruoansulatusta sivustoja poimittiin geeli käyttäen Zymoclean Geeli DNA Recovery Kit (Zymo Research) ja tuotteita säilytettiin − 20 °C: ssa, kunnes edelleen käyttöä.,
Kloonaus ja ilme rekombinantti monoklonaalinen vasta-aineet
Rajoitus ruoansulatusta täyspitkä HC-ja LC-insertit ja ilme vektorit (pCMV-CD30-4IE3_HC ja pCMV-CD30-4IE3_LC) suoritettiin rajoitus entsyymejä BssHII, NheI-ja HindIII (New England Biolabs). Tuloksena tuotteet on lastattu 2% TBE-agaroosia geelit ja bändit ~ 5.9 kb HC vektori selkäranka, 5.3 kb LC vektori selkäranka, ~ 370 bp HC-insertit, ja ~ 340 bp LC insertit olivat koko-valittu agaroosia geelit ja puhdistetaan edellä kuvatulla tavalla., Ligations vastaavan insertit ja vektorit amplified HC-ja LC clonotypes suoritettiin käyttämällä instant tahmea lopussa DNA ligaasia (New England Biolabs) ja muuntaa yksi-shot kemiallisesti toimivaltaisten E. coli TOP10-solut (IBA), valmistajan ohjeiden mukaisesti. Plasmidi-dna: t eristettiin muuttunut siirtomaita (8-16 siirtomaita) käyttäen QIAprep spin miniprep-kitin (Qiagen); yhtäläisyyksiä konsensus-sekvenssejä oli vahvistettu käyttäen kapillaari Sanger-sekvensointi., HC-ja LC-plasmidi DNA-sekvenssit, joka vastasi lähinnä konsensus sekvenssit olivat co-transfektoiduissa ihmisen alkion munuaisten solu line HEK 293 T (ATCC, CRL-11268-solut). HEK 293-T-solut viljeltiin käyttäen runsaasti glukoosia (4,5 g/L D-glukoosia) Dulbecco ’s Modified Eagle’ s Medium (Gibco BRL) täydennettynä lämpö-inaktivoitu ultra-alhaiset IgG-naudan sikiön seerumi (Thermo Fisher Scientific), 100 U/mL penisilliiniä ja 100 µg/mL streptomysiiniä. Puhdistettu plasmidi-dna: t varten pariksi HC-ja LC clonotypes olivat co-transfektoiduissa osaksi 85-95% yhtyviä HEK 293-T-solut käyttäen PEI (polyethyleneamine, Polysciences)., Kulttuuri supernatantit kerättiin neljä päivää transfektion jälkeen ja TT-antigeeni-erityinen clonotypes tunnistettiin epäsuora ELISA.
Entsyymi-immunologiset määritykset (ELISA-testit)
– Meillä suoritetaan epäsuora ELISA-määrityksissä tunnistaa mAbs johdettu immunisoitu proband sitova TT-antigeenia käyttäen transfektoiduissa cell culture supernatantit. Nunc-Immuno MicroWell 96-sekä kiinteät levyt (Thermo Fisher Scientific) oli päällystetty 100 µL, 10 µg/mL-TT-antigeeni (Statens Serum Institute, Copenhagen, Tanska) 50 mM karbonaatti buffer pH 9.,6, inkuboidaan yön yli 4 °C, pestiin kolme kertaa PBS, ja tukossa 2% rasvaton maitojauhe (Bio-Rad) PBS: 150 min huoneenlämmössä. Kun esto, 120 µL 1:2 sarjaan laimennettu transfektoiduissa supernatantit vuonna PTM (PBS, 0.1% Tween-20, 2% rasvaton maitojauhe) lisättiin kuoppiin, 350 ng hiiren anti-TT mAb (GeneTex) oli soveltaa yhtä hyvin kuin positiivinen kontrolli, ja levyt olivat inkuboitiin 1 h huoneenlämmössä. Lautaset pestiin kolme kertaa PBS-T :llä (0.,1% Tween-20) ja 50 µL 1:2000 laimennos goat anti-ihmisen kappa LC-HRP sekundaarinen vasta-aine (Thermo Fisher Scientific) lisättiin kuoppiin 50 µL 1:2000 laimennos vuohen anti-hiiri IgG-HC-HRP sekundaarista vasta-ainetta (Sigma #A0168) lisättiin positiivinen kontrolli no, levyt olivat inkuboitiin 2 min huoneenlämmössä ja pestiin kolme kertaa PBS-T väri kehittäminen, me lisättiin 50 µL one-step Ultra TMB-ELISA-alustan (Thermo Fisher Scientific) kohti, inkuboitiin levyjä 5 min huoneenlämmössä, ja pysähtyi Ag:Ab sitova reaktio lisäämällä 50 µL 2 M H2SO4., Absorbanssi mitattiin 450 nm: ssä GloMax Multi Detection Systemin (Promega) avulla. ELISA-määrityksiä varten kaikki clonotypes suoritettiin triplicates, arvot normalisoitiin poistaa tausta signaaleja, ja virheet olivat edustettuina standardi poikkeamat keskiarvosta.
Analyysi kimeerinen amplicon muodostumisen aikana sisäkkäisiä PCR
Neljä määritellään HC-LC amplicons kertyi monistamalla HC-ja LC vastaavasta pCMV plasmidit (ks. edellä) ja käyttämällä PCR-kokoonpano reaktio tuottaa neljä erillistä HC-LC-kokoonpanot., HC-ja LC-plasmidi-dna: t käytettiin malleina PCR-monistus ja Top1, Top2, Top3, ja Top4 klonaalinen ketju paria käyttäen spesifisiä alukkeita kunkin VH ja VK-geenin perheet ja IgG-ja IgK jatkuva alueilla (Lisää tiedosto 1: Taulukko S2 ja Kuva S6a). Jokaiseen 25 µL PCR-reaktioon lisättiin puhdistettua plasmidi-DNA: ta (10 ng), joka sisältää 0,4 µM kutakin primeria, 200 µM dNTP-seosta, 1× Q5-reaktiopuskuria ja 0,2 U/µL Q5-hifi-DNA-polymeraasia., Thermal pyöräily suoritettiin ensimmäinen denaturaatio, 98 °C: ssa 3 min, jonka jälkeen 25 denaturaatio, 98 °C 30 s, hehkutus – /tiedostotunnistetta 71 °C: ssa 1 min (HC plasmidi-DNA) tai hehkutus-64 °C 1 min ja pidennys 72 °C 1 min (LC plasmidi-DNA), jonka jälkeen lopullinen laajennus vaihe 72 °C 5 min. PCR-tuotteet ladattiin erillisiin 1% TBE-agarose-geeleihin ja erotettiin 100 V: llä 60 min. Halutut DNA-tuotteet ~ 400 bp (HC: lle) ja ~ 350 bp (LC: lle) valittiin ja uutettiin geelistä edellä kuvatulla tavalla., Puhdistettu HC-ja LC PCR-tuotteita käytettiin malleja HC-ja LC-kokoonpanoon päällekkäin extension PCR (Lisää tiedosto 1: Kuva S6b). Lyhyesti, 5 ng kunkin HC ja vastaavat pariksi LC DNA lisättiin kuhunkin 50 µL PCR-reaktio sisältää 1× tikka 1-step RT-PCR master buffer (Roboklon), 2× dART master-entsyymin (Roboklon), ja 0,4 µM kunkin IgG-ja IgK vakio alue pohjamaali (Lisää tiedosto 1: Taulukko S2)., Thermal pyöräily suoritettiin RT inaktivaatio 95 °C 3 min, jonka jälkeen kolme denaturaatio 95 °C 20 s, hehkutus 56 °C: ssa 30 s ja pidennys 72 °C 2 min, jonka jälkeen 25 denaturaatio 95 °C 20 s, hehkutus 56 °C: ssa 30 s ja pidennys 72 °C 4 min, jonka jälkeen lopullinen laajennus vaihe 72 °C 5 min. Kokoonpano tuotteet on lastattu 1% TBE-agaroosia geelit ja erotettu 100 V 45 min. Kokoonpanotuotteet ~ 750 bp valittiin ja uutettiin agarose-geelistä edellä kuvatulla tavalla., Yksilöllisesti koottu HC-LC klonaalinen paria yhdistettiin yhteen ja käyttää mallina sisäkkäisiä PCR-monistus, jossa spesifisiä alukkeita IgG-ja IgK jatkuva alueilla (Lisää tiedosto 1: Taulukko S2, Kuva S6c). Sisäkkäiset PCR-reaktio ja lämpö pyöräily olosuhteet olivat samat kuin on kuvattu ”Sisäkkäisiä PCR-monistus ihmisen B-solu kokoonpano tuotteita” – osio, paitsi että PCR-monistus tehtiin 25 jaksoa. PCR-tuotteet on lastattu 1% TBE-agaroosia geelit, erotettu 100 V 60 min ja haluamasi tuotteet ~ 720 bp uutettiin kuten edellä on kuvattu., Sekvensointi kirjastot yksittäiset kokoonpanot ja sekoittaa kokoonpanoja jälkeen sisäkkäisiä PCR valmistettiin seuraavat Illumina TruSeq DNA-näytteen valmistelu opas ja 2 × 250 base pariksi-end lukee saatiin käyttämällä Illumina MiSeq-alustan.