sejtvonalak
A HEK 293T sejtvonal nyerték az American Type Culture Collection (ATCC CRL-3216). A Kt13 és kt22 egér hybridoma sejtvonalakat a Hybridoma Bank (Dshb) fejlődési vizsgálatokból nyerték. Mindkét sejtvonalat a Kazumasa Takeda és Asako Sugimoto (DSHB hybridoma products KT13 és KT22) helyezte a DSHB-be., Az 5e4/1F1 jelű egér hybridoma sejtvonalat Miha Kosmač és Vladka Čurin Šerbec (Ljubljanai Egyetem) biztosították. A HEK 293t és hybridoma sejteket DMEM-ben (Gibco), 13% FBS (Gibco), 1× Penicillin/Streptomycin (Thermo Fisher) és 1× GlutaMAX (Gibco) növesztették. Az egyes hibridomákból származó antitest HC és LC szekvenciákat reverz transzkripciós polimeráz láncreakcióval (RT-PCR) és kapilláris szekvenálással (Eurofins Genomics) határoztuk meg.,
Cikloheximid-kezelés és mikroszómakészítés
minden pipettázási lépést jégen végeztünk, és 4 °C-on centrifugálást végeztünk egy Eppendorf 5810r centrifugával, rögzített szögű F rotorral-45-30-11. Protein LoBind 1,5 mL centrifugacsöveket (Eppendorf) használtak a sejtek tapadásának minimalizálására a cső falához. HEK 293t sejtek( 1 millió), egér hybridoma sejtek (1 millió 5E4, KT13 és kt22 sejtek keverve arány 1:1:1), ARH-77 leukémia sejtek (ATCC CRL-1621, 1 millió), vagy frissen izolált humán CD19+ B sejtek pre – és post TD-emlékeztető immunizációs minták (1.,5 millió forint) volt újraszuszpendált 1 mL PBS-50 µg/mL cycloheximide, valamint lappangási idő 10 perc parkolóhely, riboszómákat kapcsolódó messenger Rns (mrns) a durva leggyakoribb típusa. A sejteket 4 °C-on 10 percen át 300 g-mal pelletáltuk, majd 120 µL-es nagy sűrűségű lízispufferben (25 mM HEPES-KOH pH 7,2, 110 mM kálium-acetát, 5 mM magnézium-acetát, 1 mM EGTA , 25% szacharóz, 5% glicerin, 1 mM 1,4-ditiotreitol , 1× teljes EDTA-mentes proteáz inhibitor koktél, 0,1 mg/mL cikloheximid, 0,015% digitonin és 400 E/ML ribolock RNáz inhibitor )., A sejt – és organellalízis 10 perces jégen történő inkubálással fejeződött be. Mindegyik homogenátot két 55 µL-es aliquotra osztottuk, és két friss fehérje LoBind csőbe helyeztük át. A csöveket 600 g-on centrifugálták 3 percig 4 °C-on, hogy a sejtmagokat és a sejthulladékokat pelletálják. A membránfrakciókat és citozolt tartalmazó csövekből összesen 40 µL felülúszót juttattak át friss fehérje LoBind csövekbe, és a szacharóz koncentrációját 40 µL nukleázmentes víz hozzáadásával 0,37–0,40 M-re (12-13% w/w) hígították. A mikroszómákat ezután 20 800 g-os centrifugálással ültették 120 percig 4 °C-on., A cytosol-tartalmú supernatants deportáltak, illetve a membrán pellet volt újraszuszpendált által pipettázási 10× fel-le a 85 µL mosó puffert (25 mM HEPES-KOH pH 7,2, 110 mM-es kálium-acetát, 2,5 mM-es magnézium-acetát, 1 mM EGTA, 1 mM, 1,4-dithiothreitol, 1× teljes EDTA-ingyenes proteáz-gátló, koktél, 0.1 mg/mL cycloheximide, 0.004% digitonin, 400 U/ml RiboLock RNase gátló). A mikroszómákat ismét 20 800 g-os centrifugálással ültették le 60 percig 4 °C-on., A szupernóvánsokat kidobták, és a mikroszómás pelleteket 20 µL mosópufferben reszuszpendálták, és további felhasználásig jégen tartották.
Transzmissziós elektronmikroszkópos
Minta aliquot 3,5 µL újraszuszpendált HEK 293T kísérletek alkalmazták frissen ragyog lemerült Quantifoil hálózatok (Quantifoil, Németország) borított további 2 nm-es szén-dioxid-támogatja a filmet, flash-fagyott folyékony etán segítségével Vitrobot dugattyút (FEI). A mintákat egy 120 kV-os Tecnai Spirit transmission elektronmikroszkópon (Fei) utánozták, amely 2 × 2 k Eagle CCD kamerával (FEI) volt felszerelve., A mikrográfokat alacsony dózisú krio körülmények között, 42 000× névleges nagyítással (képpontméret objektumméretben: 5,2 Å/px) rögzítették-2-4 µm − es defókusz alkalmazásával. Az adatgyűjtést manuálisan vagy teljesen automatikusan végeztük a Legnon használatával .
emulzió RT-PCR szerelvény egér hybridoma mikroszómákkal
184 µL RT-PCR mesterkeverékben hígítottunk 1× Verso 1 lépéses RT-PCR mesterkeveréket (Thermo Scientific), 1× Verso enzimkeveréket (Thermo Scientific), 0.,5 µg / µL BSA, 100 µg/mL cikloheximid, és reverz transzkripcióhoz és HC-hez és LC-szereléshez használt primerek (0,8 µM TitA_MID1_IgM_rev és TitB_MID12_IgK_rev; 0,16 µM mindegyik primer OE_MHV_fwd és OE_MKV_fwd). Az alapozó szekvenciákat további 1. fájlban mutatjuk be: S1A ábra. az így kapott 200 µL vizes oldatot cseppenként hozzáadva (13 aliquot 15 µL 30-s intervallumban) 800 µL olajfázissá alakítottuk a Ge et al. (Ásványolaj, Sigma M5904, 4,5% Span 80, Sigma S6760, 0,4% Tween 80, Sigma P8074 és 0.,05% Triton X-100, Sigma T8787) folyamatos keverés közben mágneses keverővel., Hat aliquot 100 µL minden a keletkező emulzió kerültek át PCR cső alá thermocycling a következő feltételeket: reverz transzkripció 50 °C-on 15 percig, RTase inaktiválása a 95 °C-on 2 perc, akkor négy ciklusban denaturáció: 95 °C 20 s, lágyítás rampdown-tól 60 °C-tól 50 °C-50 s jelent, 72 °C-on 1 percig, majd 16 ciklusok a denaturáció: 95 °C 20 s, lágyítás 60 °C-30 s jelent, 72 °C-on 1 percig, majd egy végső kiterjesztését lépés 72 °C-on 5 percig., Ezzel párhuzamosan nyílt RT-PCR kontrollt végeztünk 4 µL reszuszpendált mikroszómának 46 µL RT-PCR master mixben való hígításával, és a reakciót az RT-PCR emulzióval párhuzamosan termociklálva. A PCR összeszerelési termékeket az emulzióból izobutanollal (2-metil-1-propanol, Sigma) és a Zymo DNS tiszta & koncentrátor-5 készlet (Zymo Research) segítségével nyerték ki, amint azt korábban közzétették . A kapott DNS-t és a PCR-terméket a nyílt PCR-kontrollból egy 1,2%-os TBE-agaróz gélen töltötték be, majd 60 percen keresztül 90 V-tal elválasztották., A 800-950 bp méretű összeszerelési termékeket az agaróz gélből választották ki, a termékeket pedig Zymoclean gél DNS-helyreállítási készlet segítségével nyerték vissza. Az összeszerelési termékeket 6 mM-es Tris − Cl pH 8-ban eluálták, és-20 °C-on tárolták további elemzésig.,
Beágyazott PCR amplifikáció az egér hybridoma közgyűlés termékek
Miután az emulzió közgyűlés reakció, a közgyűlés termékek további erősített adapterrel alapozók TitA_fwd, 5′ CGT ATC-GCC TCC TK GCG CCA TCA G 3′, valamint TitB_rev, 5′ CTA TGC GCC-TTG CCA GCC CGC TCA G 3′, használja a Phusion high-fidelity DNS-polimeráz készlet (Finnzymes) a következő thermocycling feltételek: Kezdeti denaturáció 98 °C-on 30 s, akkor 15 ciklus a denaturáció 98 °C-on 7 s lágyítás/kiterjesztését 72 °C-on, 30 s, majd egy végső kiterjesztését lépés 72 °C-on 5 percig., A PCR termékeket a zymo DNS Clean & koncentrátor-5 készlettel tisztítottuk. A párosítás, a HC pedig LC a közgyűlés termékek ezután elemezték a PCR segítségével beágyazott specifikus primerek a három különböző HC három különböző LC (Előfordulhat, hogy a fájl 1: Ábra S1e) segítségével a Phusion high-fidelity DNS-polimeráz készlet a következő thermocycling feltételek: kezdeti denaturáció 98 °C-on 30 s, akkor 24 ciklus denaturáció 98 °C-on 7 s lágyítás/kiterjesztését 72 °C-on, 30 s, majd egy végső kiterjesztését lépés 72 °C-on 5 percig., A beágyazott PCR-termékeket 1,2%-os TBE-agaróz gélre töltötték, és 90 V-os felbontással 40 percig elválasztották. Valós idejű, beágyazott PCR számszerűsítésére a kereszt-szennyeződés került sor, triplicates ugyanazzal a beágyazott primerek segítségével SYBRGreen master mix (Applied Biosystems) a StepOne qPCR cycler (Applied Biosystems) a következő thermocycling feltételek: kezdeti denaturáció: 95 °C-on 10 percig, majd 40 ciklus denaturáció: 95 °C-on 15 s, lágyítás 56 °C-on 30 s jelent, 72 °C-on 45 s., Az amplifikált összeszerelési termékek kezdeti bőségét a 2^(-deltaCt) módszerrel számítottuk ki, és bar diagramokként ábrázoltuk, hibasávokkal, amelyek standard eltérést mutatnak az átlagtól.
immunizálás és CD19+ B sejtek izolálása perifériás teljes vérmintákból
Az ebben a vizsgálatban használt humán perifériás teljes vérmintákat in-ből nyerték.vent Diagnostica GmbH mint melléktermékek rutin diagnosztikai eljárások. be.,a vent Diagnostica GmbH az adományozó írásos beleegyezését adta a melléktermékek kutatáshoz való felhasználásához, és etikai jóváhagyással rendelkezik a Freiburg Etikai Bizottság Nemzetközi (FEKI kódex 011/1763) részéről a minták terjesztésére. Az egészséges probandot tetanusz toxoiddal (tt)/Diptheria toxoiddal (DT) (TD-pur®; 20 nemzetközi egység tt és 2 Ne DT; Novartis, Basel, Svájc) emlékeztető immunizációnak vetették alá., A CD19+ B sejtek CD19 pluriBead Cell Separation Kit (pluriSelect GmbH, Leipzig, Németország) alkalmazásával történő izolálására a K2-EDTA perifériás teljes vérét (0.nap) és a TD emlékeztető oltást követő hét napot használták fel a gyártó protokollját követve. Elszigetelt CD19+ B-sejt pellet volt mosni 1 mL hideg PBS pedig centrifugált 300 g, 10 perc, 4 °C-Cell pellet megfelelő 1,5 millió B-sejtek mindkét elő -, utó-immunizálás minták tartották a jégen, amíg cycloheximide kezelés microsome készítmény.,
Emulzió RT-PCR közgyűlés segítségével az emberi B-sejt kísérletek
adtunk 2 µL hígított kísérletek készült fagyasztott ARH-77 sejtek (mint belső párosítás control) 26 µL újraszuszpendált kísérletek a B sejtek mindkét elő -, utó-Td immunizálás, szóval, hogy az utolsó töredéke ARH-77 kísérletek 0,5% (v/v). A mikroszómák szuszpenziójának 16 µL-ét 184 µL RT-PCR mesterkeverékben hígítottuk, amely 1× dART 1 lépéses RT-PCR mester pufferkeveréket (Roboklon), 2× Dart mester enzimkeveréket (Roboklon) tartalmaz, 0.,5 µg / µL BSA, 100 µg/mL cikloheximid és reverz transzkripciós (IgM, IgG és IgK) és nehéz (VH) és könnyű lánc (VK) szerelvényre szolgáló primerek. Az RT-PCR mesterkeverék Primer szekvenciáit és koncentrációját az 1. kiegészítő fájl tartalmazza: S2 táblázat., A kapott 200 µL vizes oldat használták formában a víz-olaj emulzió által keverése mellett cseppenként tegyünk bele kívül (13 aliquot 15 µL 30 másodperces időközönként) 800 µL olaj fázis áll 73% emulzió komponens 1, 7% – os emulzió alkatrész 2-es, 20% – os emulzió komponens 3 Micellula DNS-emulzió, illetve tisztító kit (Roboklon) során folyamatos keverés közben a mágneses keverő., Hat aliquot 100 µL minden a keletkező emulzió kerültek át PCR cső alá thermocycling a következő feltételeket: Reverz transzkripció 55 °C-on 30 perc, kezdeti denaturáció: 95 °C, 3 perc, aztán három ciklus a denaturáció: 95 °C 20 s, lágyítás 56 °C-on 30 s jelent, 72 °C-on 2 perc, akkor 20 ciklus denaturáció: 95 °C 20 s, lágyítás 56 °C-on 30 s jelent, 72 °C-on 4 percig, majd egy végső kiterjesztését lépés 72 °C-on 5 percig., A PCR összeszerelési termékeket az emulzióból izobutanollal (2-metil-1-propanol, Sigma) és a Zymo DNS tiszta & koncentrátor-5 készlet (Zymo Research) segítségével nyerték ki, amint azt korábban közzétették . A kapott DNAs-t 1% – os TBE-agaróz gélre töltöttük, és 45 percig 100 V-tal választottuk el. Közgyűlés termékek 700-800 bp voltak méret-válogatott a agaróz gél, helyreállítani egy Zymoclean Gél DNS-Helyreállítási készlet, eluálódnak 6 mM Tris-Cl pH 8, tárolt, a − 20 °C-on, míg a további elemzést.,
A humán B cell assembly products beágyazott PCR-amplifikációja
a HC-LC assembly products további további erősítéséhez beágyazott PCR-amplifikációt végeztünk IgM, IgG és IGK állandó régiókra specifikus beágyazott primerekkel (további fájl 1: S2 táblázat). A PCR-reakció 0,4 µM koncentrációban beágyazott primereket, 200 µM dNTP-keveréket, 1× Q5 reakciópuffert és 0,02 U/µL Q5 nagy hűségű DNS-polimerázt (New England Biolabs) tartalmazott 50 µL reakciótérfogatban, 3 µL összeszerelt DNS-sel., Beágyazott PCR amplifikáció végeztek, a következő thermocycling feltételek: kezdeti denaturáció 98 °C-on 3 perc, majd 34 ciklus denaturáció 98 °C-on 30 s lágyítás/kiterjesztését a 71 °C-on 1 percig, majd egy végső kiterjesztését lépés 72 °C-on 5 percig. A mintákat három különböző PCR ciklusszám (28, 31 és 34 ciklus) után gyűjtötték össze. Az amplifikált PCR termékeket 1% TBE-agaróz gélre töltötték, és 60 percig 100 V-tal elválasztották., A kívánt termékek ~ 710 bp kibontotta a fent leírt sorrend könyvtárak készítették a következő Illumina TruSeq DNS-minta-előkészítési útmutató 2 × 250 bázis párosított-end olvassa volt szekvenált segítségével az Illumina MiSeq platform.
A párosított antitest nehéz és könnyű láncú repertoárjainak bioinformatikus analízise
a MiSeq szekvenálási platform 2 × 250 bázispárosított végének Demultiplexelését adapterindexek alapján végezték, és a szekvenálási adatokat fastq formátumban nyerték., Az összes nukleotid legalább 10, 50% – át kitevő Phred minőségi pontszámával csak az IgM, IgG és IgK konstans region szekvenciákat vizsgálták és vizsgálták. Olvassa el pár hiányzik állandó régió szekvencia vagy mutatja HC-MD vagy LC-LC szerkezet szűrtek ki, a fennmaradó olvassa alakították át fastq formátumban alapanyagául szolgáló elemzés MiXCR (v1.2) az összehangolás olvas referencia-V(D), J a C gén szekvenciák a IMGT adatbázis , kivonása, valamint a klaszter a CDR-H3 nukleotid (Előfordulhat, hogy a fájl 1: Táblázat S1)., A frameshifteket vagy stop kodonokat tartalmazó HC-CDR3 szekvenciákat kevesebb mint két olvasással kiszűrtük. Létrehoztunk egy HC-LC párosítási statisztikai fájlt, amely bemutatja a párosított VH-VK génhasználatot a teljes párosított HC-LC gén repertoárokban. A hőtérképeket R segítségével állították elő, és grafikusan jelenítették meg a ggplot2 segítségével. Ezután az egyes tt-specifikus HC-CDR3 szekvenciákat úgy azonosítottuk, hogy összehasonlítottuk a TD után emlékeztető immunizációs mintából nyert HC-CDR3 aminosavszekvenciákat a korábban jelentett TT-specifikus HC-CDR3 szekvenciákkal .,
A teljes hosszúságú HC és LC szekvenciák PCR-amplifikációja
egy kétlépcsős PCR-alapú amplifikációs módszert (további 1.fájl: S5 ábra) terveztünk, hogy a restrikciós emésztési helyeket potenciálisan TT-specifikus HC-re és LC-re építsük, teljes V(D)J génszekvenciával. Ez lehetővé tette a HC és LC szekvenciák hatékony klónozását a megfelelő expressziós vektorokba, valamint rekombináns antitestek előállítását in vitro kötő vizsgálatokhoz., Röviden, kiválasztottuk 14 párosított HC-LC CDR3 clonotypes nyert IgG szekvenálás utáni TD emlékeztető immunizálás alapján a frekvencia, párosítás pontosságát, és fold különbség top1 LC-CDR3 és top2 LC-CDR3 párosítva az adott HC-CDR3 szekvencia. A TD emlékeztető utáni immunizálásból izolált fagyasztott B sejtekből TRIzol reagens (Ambion) tisztítással teljes RNS-t extraháltunk a gyártó utasításai szerint. Az első lépésben az RT-PCR erősítést minden kiválasztott HC – és LC-CDR3 klonotípushoz külön hajtottuk végre a dart 1-step RT-PCR kit (Roboklon) segítségével., Az RT-PCR mesterkeverék (25 µL) HC és LC v génspecifikus, bsshii-restrikciós helyű forward primereket tartalmazott, valamint egyedi CDR3-specifikus reverz primereket, 18 FR4 régió nukleotidokkal, 0,4 µM koncentrációban (további fájl: S3 táblázat és S5 ábra), 1× dART 1-step RT-PCR master pufferkeverék, 1× dART master enzimkeverék és 4,5 ng teljes RNS., Thermocycling feltételek a következők voltak: reverz transzkripció 55 °C-on 30 perc, kezdeti denaturáció: 95 °C, 3 perc, aztán 23 ciklus denaturáció: 95 °C 20 s, lágyítás 56 °C-on 30 s jelent, 72 °C-on 90 s, majd egy végső kiterjesztését lépés 72 °C-on 5 percig. Az RT-PCR termékeket az Agencourt AMPure XP – PCR tisztítókészlettel (Beckman Coulter) tisztítottuk a gyártó utasításait követve, majd 6 mM-es tris-Cl pH 8.0-ban eluáltuk., A második lépésben a tisztított RT-PCR termékeket a Q5 high-fidelity DNS polimeráz (New England Biolabs) felhasználásával PCR-amplifikációhoz sablonként használták. A beágyazott PCR master mix (50 µL) szereplő, előre alapozók kódolás egy BssHII korlátozás oldalon három nukleotid SZÉNHIDROGÉN-vagy LC germline gén szekvencia együtt reverz primerek, amely a teljes FR4 régió NheI/HindIII korlátozás túlnyúlások a 0.4-µM koncentrációban (Előfordulhat, hogy a fájl 1: Táblázat S3 Ábra S5), 4 µL tisztított DNS-t, 200 µM dNTP mix, 1× Q5 reakció puffer, 0.,02 U/µL Q5 nagy hűségű DNS-polimeráz (New England Biolabs). A termociklálási feltételek a következők voltak: kezdeti denaturálás 98 °C-on 3 percig, majd 16 denaturációs ciklus 98 °C-on 30 másodpercig, 69 °C-on 30 °C-on, majd 72 °C-on 1 percig történő meghosszabbítás, majd egy végső kiterjesztési lépés 72 ° C-on 5 percig. A PCR-termékeket TBE-agaróz gélen választottuk el, a teljes hosszúságú HC-és LC − amplikonokat a zymoclean Gel DNA Recovery Kit (Zymo Research) segítségével extraháltuk a gélből, és a termékeket további felhasználásig-20 °C-on tároltuk.,
rekombináns monoklonális antitestek klónozása és expressziója
a teljes hosszúságú HC és LC betétek és expressziós Vektorok (pCMV-CD30-4IE3_HC és pCMV-CD30-4IE3_LC) lebontását a BssHII, NheI és Hindii (New England Biolabs) restrikciós enzimekkel végezték. A keletkező termékek betöltött 2% TBE-agaróz gél, zenekarok ~ 5.9 kb a HC vektor gerincét, 5.3 kb az LC vektor gerincét, ~ 370 bp a HC lapkák, meg ~ 340 bp LC betétek voltak méret-kiválasztott agaróz gél, tisztított, mint a fent leírt., Ligations a megfelelő lapkákat, majd vektorok erősített HC, valamint LC clonotypes végeztek segítségével azonnal ragadós-end DNS ligase (New England Biolabs), illetve átalakult one-shot kémiailag illetékes E. coli TOP10 sejtek (IBA) kövesse a gyártó utasításait. A plazmid Dnákat transzformált kolóniákból (8-16 kolóniákból) izolálták a QIAprep spin miniprep kit (Qiagen) segítségével; a konszenzus szekvenciákhoz való hasonlóságokat kapilláris Sanger szekvenálással erősítették meg., A konszenzusos szekvenciákhoz legközelebb álló HC és LC plazmid DNS-szekvenciákat a humán embrionális vesesejt-vonal HEK 293 T (ATCC, CRL-11268) sejtjeibe társították. A hek 293 T sejteket gazdag glükózzal (4,5 g/L D-glükóz) tenyésztették Dulbecco módosított Eagle ‘ S Medium (Gibco BRL), amelyet hő-inaktivált ultra-alacsony IgG magzati szarvasmarha szérummal (Thermo Fisher Scientific), 100 U/mL penicillinnel és 100 µg/mL sztreptomicinnel egészítettek ki. A párosított HC és LC klonotípusok tisztított plazmid DNAs-ját 85-95% – os összefolyó HEK 293 t-sejtekké társították Pei (polietilén-amin, Poliszciencia) alkalmazásával., A tenyésztett szupernatánsokat négy nappal a transzfekció után gyűjtötték, a TT antigénspecifikus klonotípusokat pedig közvetett ELISA-val azonosították.
enzimhez kötött immunszorbens vizsgálatok (ELISA)
közvetett ELISA vizsgálatokat végeztünk az immunizált proband tt antigénhez való kötődéséből származó MAB-k azonosítására a transzfektált sejttenyészet szupernatánsok segítségével. Nunc-Immuno MicroWell 96-well solid plates (Thermo Fisher Scientific) were coated with 100 µL of 10 µg/mL tt antigen (Statens Serum Institute, Koppenhága, Dánia) in 50 mM carbonate buffer pH 9.,6, 4 °C-on egy éjszakán át inkubálva, háromszor PBS-vel mosva, 2% zsírmentes szárított tejjel (Bio-Rad) blokkolva PBS-ben 150 percig szobahőmérsékleten. A blokkolás után 120 µL 1:2 sorozatosan hígított transzfektált szupernatánsokat (PBS, 0,1% Tween-20, 2% zsírmentes szárított tej) adtak a kutakhoz, 350 ng egér anti-TT mAb-t (GeneTex) alkalmaztak egy kútra, valamint pozitív kontrollt, és a lemezeket szobahőmérsékleten 1 órán át inkubálták. A lemezeket háromszor mossuk PBS-T-vel (0.,1% Tween-20), valamint 50 µL 1:2000 hígítás kecske anti-humán kappa LC-HRP másodlagos antitest (Thermo Fisher Scientific) egészült ki, hogy a kutak, 50 µL 1:2000 hígítás kecske anti-egér IgG-MD-HRP másodlagos antitest (Sigma #A0168) egészült ki, hogy a pozitív kontroll nos, tányérok voltak lappangási idő 2 perc szobahőmérsékleten, majd a mosott háromszor a PBS-T, A szín-fejlesztés, adtunk 50 µL egy lépésben Ultra TMB-ELISA szubsztrát (Thermo Fisher Scientific) per nos, inkubáljuk a lemezeket 5 percig szobahőmérsékleten, majd megállt az Ag:Ab kötelező reakció hozzáadásával 50 µL 2 M H2SO4., Az abszorbanciát 450 nm-en mértük a GloMax Multi Detection System (Promega) segítségével. Az összes klonotípus ELISA-vizsgálatát három példányban végezték el, az értékeket normalizálták a háttérjelek eltávolítására, a hibákat pedig az átlagtól való standard eltérésként ábrázolták.
Elemzése kiméra amplicon kialakulása során beágyazott PCR
Négy meghatározott HC-LC amplicons keletkezett erősítésével, a HC pedig LC a megfelelő pCMV plazmidok (lásd fentebb) segítségével a PCR közgyűlés reakció, hogy létrehoz a négy különböző HC-LC szerelvények., A HC és LC plazmid DNAs sablonokat használtak a Top1, Top2, Top3 és Top4 klonális láncpárok PCR-amplifikálásához, az adott VH és VK géncsaládokra, valamint az IgG és IgK állandó régiókra jellemző primerek felhasználásával (további fájl 1: S2 táblázat és S6A ábra). Tisztított plazmid DNS-t (10 ng) adtunk minden 25 µL-es PCR-reakcióhoz, amely 0,4 µM-t tartalmaz minden egyes alapozóból, 200 µM dNTP-keverékből, 1× Q5 reakciópufferből és 0,2 U/µL Q5 nagy hűségű DNS-Polimerázból., Termikus kerékpározás végezték a kezdeti denaturáció 98 °C-on 3 perc, majd 25 ciklus denaturáció 98 °C-on 30 s, lágyítás/kiterjesztését a 71 °C-1 perc (HC plazmid DNS-t), vagy lágyítás 64 °C 1 min jelent, 72 °C 1 min (LC plazmid DNS-t), majd egy végső kiterjesztését lépés 72 °C-on 5 percig. A PCR termékeket külön 1% – os TBE-agaróz gélekre rakodtuk, és 60 percig 100 V-tal választottuk el őket. A kívánt, ~ 400 bp (HC) és ~ 350 bp (LC) méretű DNS-termékeket a fent leírtak szerint kiválasztották és kivonták a gélből., A tisztított HC és LC PCR termékeket a PCR átfedés kiterjesztésű PCR (1.kiegészítő fájl: S6B ábra) HC és LC összeszerelés sablonjaként használták. Röviden, minden egyes HC-ből 5 ng-t és a hozzá tartozó párosított LC DNS-t hozzáadtunk minden 50 µL-es PCR-reakcióhoz, amely 1× Dart 1 lépéses RT-PCR master puffert (Roboklon), 2× Dart master enzimet (Roboklon), valamint 0,4 µM-t tartalmaz minden IgG és IgK állandó régió alapozóból (további fájl 1: S2 táblázat)., Termikus kerékpározás volt végezni RT inaktiválása a 95 °C-on 3 perc, amelyet három ciklus denaturáció: 95 °C 20 s, lágyítás 56 °C-on 30 s jelent, 72 °C-on 2 perc, majd 25 ciklus denaturáció: 95 °C 20 s, lágyítás 56 °C-on 30 s jelent, 72 °C-on 4 percig, majd egy végső kiterjesztését lépés 72 °C-on 5 percig. Az összeszerelési termékeket 1%-os TBE-agaróz gélekre rakodtuk, és 100 V-os felbontással 45 percig választottuk el. A ~ 750 bp összeszerelési termékeket a fent leírtak szerint az agaróz gélből kiválasztották és kivonták., Az egyedileg összeszerelt HC-LC klonális párokat egyesítették, és sablonként használták beágyazott PCR-erősítéshez az IgG és IgK állandó régiókra jellemző primerekkel (további fájl 1: S2 táblázat, S6c ábra). A beágyazott PCR-reakció és a termikus ciklusok körülményei megegyeztek a “humán B-sejt-összeszerelő termékek beágyazott PCR-amplifikációja” szakaszban leírtakkal, kivéve, hogy a PCR-erősítést 25 cikluson keresztül végezték. A PCR-termékeket 1%-os TBE-agaróz gélekre rakodtuk, 100 V-tal elválasztva 60 percig, a kívánt ~ 720 bp-os termékeket pedig a fent leírtak szerint extraháltuk., Az Illumina TruSeq DNS mintaelőkészítési útmutató és az Illumina MiSeq platform segítségével 2 × 250 bázispárosított végű olvasás elkészítése után az egyes részegységekből és a kevert részegységekből álló szekvenálási könyvtárak jöttek létre.