PCR a modern molekuláris biológiai laboratóriumok technikája. Ha másolni , szekvenciálni vagy számszerűsíteni kell a DNS-t, ismernie kell a PCR-t. A rövid, PCR (polimeráz láncreakció) egy biokémiai technika, amely thermocycling, valamint enzimek, hogy gyorsan, megbízhatóan másolás DNS-t, azt találták ki, a megvilágosodás egy tudós vezetés Autópályán 128 a San Francisco-Mendocino.,
Ez a cikk ad egy rövid, alapvető áttekintést PCR, néhány tipp, hogy segítsen elkerülni a leggyakoribb buktatókat. Ha új vagy viszonylag új a PCR-hez, akkor ez az Ön számára. (És akkor is, ha tapasztalt PCR érdemes olvasni frissíteni, és talán megragad egy-két tipp!).
alapvető PCR-összetevők:
polimeráz
a polimerázok olyan enzimek, amelyek a megfelelő körülmények között új DNS-szálakat tudnak összeállítani a sablon DNS-ből és nukleotidokból. Az eredeti PCR-reakció nehézkes volt, mert a DNS denaturálásához szükséges magas hőmérséklet megöli a polimerázokat., Ez azt jelentette, hogy minden fűtési ciklus után új polimerázokat kellett manuálisan hozzáadni a reakcióhoz– ez drága törekvés. A modern PCR-ben azonban ez nem jelent problémát, mivel a modern PCR-ben használt polimerázok általában két termofil baktériumforrás, a Thermus aquaticus vagy a Pyrococcus furiosus egyikéből származnak. Ezek a polimerázok, illetve a Taq (ejtsd: “tack”) és a Pfu (ejtsd:” P-F-U”) könnyen ellenállnak a PCR-reakcióhoz kapcsolódó magas hőmérsékleteknek., Kereskedelmi Taq és PFU polimerázok tervezték sebesség, hűség, processivity (képesség, hogy teljes hosszú olvasás), és képesek olvasni GC gazdag sablonok. A vállalatok folyamatosan jönnek ki új polimerázokkal. Ezért ne elégedjen meg azzal, hogy “bármi is van a fagyasztóban”, hanem keresse meg a legjobb kereskedelmi polimerázt a PCR igényeinek megfelelően. Beszéljen a helyi értékesítési képviselőjével is, mivel gyakran ingyenes polimeráz mintákat adhatnak ki, így eldöntheti, mi a legjobb az Ön számára.
sablon DNS
Ez az a DNS, amelyhez a primereket tervezed., Ez a DNS, amit a polimeráz elolvat és lemásol. A sablon DNS lehet genomikus, plazmid vagy cDNA, de bármi is a forrás minősége számít. Minél sértetlenebb és tisztább a sablon DNS, annál könnyebb a jó PCR eredmények elérése. Ne feledje, hogy az ideális DNS-mennyiség a forrásától függ, általában 1 pg – 1 ng plazmid DNS vagy 1 ng – 1 µg genomikus DNS PCR reakciónként.
primerek
a primerek a szintetizált DNS rövid fragmensei, amelyek kötődnek a sablon DNS-hez. Meg kell terveznie egy “előre” alapozót és egy “fordított” alapozót., A forward primerje a PCR kezdetét jelöli. Ez az alapozó szekvenciája megegyezik az 5-3 sablon DNS szekvenciájával. A fordított alapozó a PCR végét jelöli. Ez az alapozó szekvenciája a sablon DNS fordított kiegészítése. Általában az alapozók 18-22 bázispár hosszúak. Azonban a hosszúságuknál fontosabb az alapozók olvadási hőmérséklete. Az alapozók olvadási hőmérsékletének 54-60°C-nak kell lennie, a lehető legközelebb egymáshoz., Vannak sok online számológépek, hogy lehet számítani primer hőkezelés hőmérséklet, a legtöbb vállalat, hogy szintetizálják primerek kínálat ilyen számológépek.
nukleotidok
mivel a DNS monomerjei, a nukleotidok szükségesek a DNS-másolatok készítéséhez. A legtöbb DNS-PCR-hez Dezoxinukleozid-trifoszfátokat (dNTPs) fog használni. Ezeket külön vagy dGTP, dCTP, dATP és dTTP mix formájában lehet megvásárolni. Bármit is vásárol, ne feledje, hogy a nukleotidok nagyon érzékenyek a fagyasztási / olvadási ciklusokra. Ezért a legjobb, ha mindig kis aliquotokat hoz létre a dNTPs-ből., Ügyeljen arra is, hogy megfelelően tárolja őket – ne használjon fagymentes fagyasztót, amely automatikus leolvasztási ciklusokon megy keresztül.
Buffer
a legtöbb kereskedelmi polimeráz ideális pufferrel van ellátva. Ezek a pufferek nem csak a megfelelő pH-t biztosítják, hanem mindig tartalmaznak olyan adalékanyagokat, mint a magnézium, a kálium vagy a DMSO, amelyek segítenek a DNS denaturálásának, a renaturálásnak és a polimeráz aktivitásának optimalizálásában. Ezekről az adalékanyagokról többet fogunk tudni egy közelgő cikkben.
Thermocycling:
itt történik a varázslat., A fenti összetevők mindegyikét egy PCR csőhöz adjuk, a csövet pedig hőkezeljük. Annak érdekében, hogy termocycling amikor PCR először találták egyedi PCR csövek kézzel mozgatjuk között fűtött vízfürdők. (És úgy gondolja, hogy a pad munkája unalmas!) Most, a “Mr.Cycles” találmányának köszönhetően, az első termocycling gép, a hőmérsékletszabályozást most automatikusan a termocyclers végzi. A következő egy tipikus PCR thermocycler profil:
inicializálás
ebben a lépésben a reakciót 30 másodperctől néhány percig 94-96°C-ra melegítjük., Ezt a lépést általában csak egyszer hajtják végre a PCR reakció kezdetén. Ez a lépés fontos a hot-start polimerázok aktiválásához, ha ilyen polimerázt használ, valamint a sablon DNS denaturálásához. Ne feledje, hogy ha a sablon GC tartalma magas, előfordulhat, hogy extra hosszú inicializálási lépést kell végrehajtania.
denaturáció (15-40-szer megismételve)
ebben a lépésben a reakciót 94-98°C-ra melegítjük 15-30 másodpercig. Ez a lépés denaturálja a DNS-ét és a primereket, ami lehetővé teszi számukra, hogy a következő lépésben lágyuljanak egymáshoz.,
lágyítás (15-40-szer megismételve)
ebben a lépésben a reakció hőmérséklete gyorsan 50-64°C-ra csökken 20-40 másodpercig. Ebben a lépésben a hőmérsékletnek elég alacsonynak kell lennie ahhoz, hogy a denaturált alapozók Watson-Crick bázispárokat képezhessenek a sablon DNS-ével. De elég magas ahhoz, hogy csak a legstabilabb (tökéletesen párosított) kettős szálú DNS-struktúrák alakuljanak ki. Általában ez a tökéletes lágyítási hőmérséklet néhány fokkal alacsonyabb, mint az alapozó pár olvadási hőmérséklete. Szintén ebben a lépésben a polimeráz kötődik a primer/sablon DNS komplex., Bár a polimeráz nem kezd el olvasni, amíg a hőmérséklet nem emelkedik a következő lépésben.
Nyúlás vagy Kiterjesztés (ismételt 15-40 alkalommal)
ebben A lépésben a reakció gyorsan melegíteni, hogy 72-80°C. Ez az, amikor a polimeráz kezdődik a felolvasás (az 5-3 irányba), majd a másolás a sablon DNS-t (a 3-5direction). A magasabb hőmérséklet ebben a lépésben csökkenti a nem specifikus primer / sablon DNS kölcsönhatásokat, ezáltal növelve a reakció specifitását., A pontos hőmérsékletet azonban a polimeráz preferenciája határozza meg, ezért olvassa el a csomagolást. Ennek a lépésnek a hossza attól függ, hogy mennyi ideig lesz a DNS-másolata. Általában a DNS-polimeráz percenként 1000 bázispárt másolhat. Ezért legalább 1 perces hosszabbítási időt kell engedélyeznie 1000 bázisra. Az inkubáció végén új, kettős szálú DNS-darabokat hoznak létre, amelyek mind sablonból, mind új DNS-ből állnak.
A 2-4. lépést ezután 15-40-szer ismételjük meg
igaz, hogy minél több ciklust programoz be, annál több DNS-másolatot hoz létre., Van azonban egy felső határ. Egy bizonyos ponton a szabad nukleotidok korlátozóvá válnak, és az idő előtti csonka DNS-másolatok problémává válhatnak. Tehát ne kapzsi a kerékpározás. Kevesebb, de jó tiszta PCR termék előnyös sok piszkos termék.
végső megnyúlás
Ez egy opcionális, de gyakran ajánlott lépés. Ebben a lépésben a reakciót 70-74°C-on tartjuk néhány percig. (Általában ugyanazt a hőmérsékletet fogja használni, mint amit a nyúlási vagy kiterjesztési lépésben használt.) Ez a lépés lehetővé teszi a polimerázok számára, hogy befejezzék az olvasást bármilyen szálon., Ez az opcionális lépés segíthet csökkenteni a csonka példányok számát a végtermékben.
végső tartás
a reakció már befejeződött. Mivel az egész folyamat néhány órát vehet igénybe, a PCR-reakciókat gyakran egyik napról a másikra, vagy ha egyébként kilépett; javasoljuk, hogy programozza be a thermocycler-t, hogy tartsa a PCR-terméket 4°C-on, amíg vissza nem tér. Ekkor elemezheti vagy felhasználhatja a terméket, vagy átviheti azt megfelelőbb hosszú távú tárolásra, mint például a hűtőszekrény.
sok szerencsét és boldog PCR-t!
Ez segített neked?, Akkor kérjük, ossza meg a hálózat.