” az RNS szekvenálás egy nagy áteresztőképességű, következő generációs szekvenálási módszer, amelyet génexpressziós és transzkriptomikai vizsgálatok elemzésére használnak.”
a ribonukleinsav egy olyan nukleinsav-típus, amely nagymértékben részt vesz az információ génexpressziójában, génszabályozásában és kódolásában/dekódolásában.
az mRNS-messenger RNS egy olyan gén kódolási szekvenciája, amely részt vesz a fehérje szintézisében, az RNS-medence körülbelül 4% – a mRNS-ből áll, míg a többi nem kódoló RNS.,
bár az RNS körülbelül 90%-a nem kódoló, ezek fontosak a különböző funkciók elvégzéséhez.
például
- tRNA-átadja az aminosavat a riboszomális helyre, míg a fordítás.
- rRNA-riboszomális RNS segít a fordításban.
- microRNA-génexpresszió és génexpresszió szabályozása.
- siRNA-védi a sejtet az exogén RNS-től.
az mRNS egy génből átírt egyszálú nukleinsav, amelyből a fehérjét lefordítják.,
az mRNS vagy az átirat csak a gén kódolási szekvenciáit tartalmazza. Így csak olyan szekvenciákkal rendelkezik, amelyek szükségesek a fehérjeformációhoz.
mostantól egy mRNS elemzésével meghatározható a kapcsolódó gén expressziós mintázata.
továbbá a teljes RNS-vizsgálat képet ad arról, hogy mely gének kapcsolódnak a fehérjeformációhoz, és melyek nem.
azt jelenti, hogy a teljes RNS, mRNS és ncrns mennyiségét a teljes RNS vizsgálatával lehet meghatározni.,
A Transzkriptomika a teljes mRNS vizsgálata – amelyet gyakran transzkriptómáknak vagy teljes RNS-nek neveznek egy sejt-vagy sejtpopulációban.
egy sejt transzkriptómájának elemzésével a génexpresszió teljes halmaza megvizsgálható. A transzkriptomikai vizsgálatokban alkalmazott egyik fontos módszer az RNS szekvenálás.
egy szervezet transzkriptoma nagyobb, összetettebb és bizonytalanabb, ellentétben a genommal.
a transzkriptóma különböző állapotban és eltérő környezetben változik., Az életmód, az étrend, a testmozgás, a környezet, a körülmények és más külső tényezők jelentős szerepet játszanak a transzkriptómás szabályozásban.
itt az RNS-szekvenálásban az mRNS-ből szintetizált cDNS-t szekvenálják és számszerűsítik egy szekvenszerben. A jelen cikkben csak az RNS-szekvenálást fogjuk megvitatni, de ezt megelőzően olvassa el a transzkriptomikákról szóló korábbi cikkünket: Mi a Transzkriptomika?,
főbb témák:
az RNS szekvenálás elve:
az RNS szekvenálás egy következő generációs, nagy áteresztőképességű RNS szekvenálás és kvantifikációs módszer, amelyet a transzkriptomika és a génexpresszió tanulmányozására használnak.
a cDNA a teljes mRNS-ből a fordított transzkripció és a töredezettség folyamatán keresztül épül fel. A szekvenálás előtt egyidejű, adaptív ligációs és könyvtári előkészítést végeznek.
a szekvenszer az mRNS-t kiegészítő cDNS-t olvassa és számszerűsíti.,
Steps in RNA-seq:
- RNA isolation
- cDNA synthesis
- Adaptor ligation
- Library preparation
- DNA fragmentation
- Sequencing
- Downstream applications
RNA isolation:
The first step in the RNA sequencing is the isolation of total RNA, mRNA or ncRNA for the experiment.,
az RNS izolálása unalmas folyamat a DNS-izolációhoz képest. Az RNS könnyen lebontható. Továbbá a szennyeződés esélye magas az RNS-izolációban.
ezért az RNS izolálása és az ehhez szükséges szakértői kéz alkalmazása során fokozott figyelmet kell fordítani.
az RNS szekvenáláshoz nagy hozamú tiszta RNS-re van szükség.
az RNS tisztaságát és mennyiségét a Nanodrop vagy qubit segítségével mérik.
Note: for isolating mRNA from the total RNA pool, one additional step is required, using the oligo dT specific column in the purification or final step of elution, total mRNA can be isolated from the rest of RNAs.
most az RNS mintánk készen áll a következő lépésre.,
reverz transzkriptáz PCR:
az RNS szekvenáláshoz egy másik innovatív készlet a reverz transzkriptáz PCR, amelyben az RNS reverz transzkriptáz DNS-be van átírva.
a DNS reverz transzkriptáz néven ismert polimeráz speciális típusával a cDNS-t az mRNS-ből szintetizálják.
Tudjon meg többet az RT PCR-ről itt: Reverse transcriptase PCR.
Second strand cDNA synthesis:
az mRNS-ből szintetizált cDNS után a második szál DNS szintézisére van szükség. Ehhez a PCR – t a szokásos Taq DNS-polimeráz segítségével végezzük a hagyományos PCR-ben.,
a polimeráz dNTPs-t ad a növekvő DNS-szálhoz a primer készlet segítségével.
Library preparation:
a library preparation vagy az NGS library preparation első lépése a fragmentációkkal kezdődik.
a speciális típusú korlátozás endonukleázok egész sor DS cDNA töredezett az NGS.
Megjegyzés:
a könyvtár előkészítése platformonként változik, mint néhány fragmentum mRNS, mielőtt reverz transzkriptázt végezne, míg mások később a cDNA elkészítése után.,
a könyvtárkészítés utolsó lépésében a végeket az adapterszekvenciákkal összekötjük, majd a végek javítására felerősítjük. a dA-tailing opcionális az mRNA könyvtár esetében.
Könyvtár Tisztítás:
a teljes könyvtár megtisztul a használatra kész DNS tisztító készlet segítségével.
az utolsó lépésben nagyon fontos, hogy megtisztítsuk a teljes fragmentum könyvtárat, hogy a könyvtár koncentrációját kvantitatív PCR vagy bioanalyzer segítségével értékeljük.,
Megjegyzés:
egy kezdő Azt hiszem, könyvtár előkészítés és a DNS töredezettség nagyon nehéz megérteni, ezért úgy gondoljuk, meg kell írni egy teljes cikket genomikus DNS töredezettség, könyvtár előkészítése és annak fontosságát, hogy az NGS.
egyébként haladjunk előre,
a következő lépésben a fragmentált DNS mintáját szekvenálásra küldjük.
DNS szekvenálás:
most a mintát szekvenálják a nagy áteresztőképességű NGS gépben, amely beolvassa a szekvenciát, valamint számszerűsíti a nukleinsavat is.,
a cDNA szekvenálása mögött álló kémia attól függ, hogy mely platformokat használjuk, bár a széles körben alkalmazott módszer a fluoreszcencia kémia használata.
a szekvenszerben az egyes fragmentumokat külön-külön “olvassuk”, majd szekvenáljuk. A végső adatokat elküldjük a bioinformatikai laboratóriumba a szekvenálás utáni elemzéshez.,
Different types of RNA and its function:
| Abbreviation | RNA types | Function |
| mRNA | Messenger RNA | Codes for protein |
| tRNA | Transfer RNA | Transfer amino acid to the site of translation., |
| rRNA | Ribosomal RNA | Catalyse the translation reaction |
| miRNA | microRNA | Gene regulation |
| siRNA | Smaller interfering RNA | Gene regulation and maintaining gene expression. |
| LncRNA | Long non-coding RNA | Transcriptional regulation and epigenetic regulations., |
| snRNA | Small nuclear RNA | Helps in mRNA splicing and related functions |
| snoRNA | Small nucleolar RNA | Helps in RNA nucleotide modification |
| piRNA | Piwi-intercalating RNA | Function in defence against transposon; transposon defence system. |
| scaRNA | Small Cajal body-specific RNA | Also helps in nucleotide modifications (a type of snoRNA)., |
| shRNA | kis hajtű RNS | szintetikus RNS molekula segít a génszabályozásban és a génexpresszió szabályozásában. |
Transcriptome data analysis:
az előző cikkben már tárgyalt unalmas feladatok egyike a transzkriptome adatok elemzése és az eredmények értelmezése. Az NGS adatai hatalmasak és összetettebbek.,
őszintén szólva, a transzkriptomika adatelemzésének tanítása nem lehetséges, gyakorlati gyakorlatot kell tennie a tanuláshoz, mégis megpróbálom megtanítani neked, mi a következő ebben a folyamatban.
különböző fragmentumokat szekvenálnak a gépben, és adatokat gyűjtenek. A következő lépésben, a töredékek szegélyező régiója alapján, az úgynevezett” kontúrok ” vannak elrendezve a splice változatok megszerzésére.
a következő lépésben a transzkriptomot összehasonlítjuk a referencia-szekvenciával, vagy összeállíthatjuk de novo.,
az RNS-seq teljes folyamatának rövid áttekintése.
teljes transzkriptóm szekvenálás:
egy sejt vagy szövet teljes transzkriptómája-minden RNS (mRNS, tRNA, rRNA, sncRNA, microRNA és siRNA) szekvenált és számszerűsített. Más szavakkal, azt mondhatjuk, hogy mind a regény, mind az ismert átiratok szekvenálhatók.
ehhez az RNS teljes készletét kivonják a szövetmintából.,
cél RNS szekvenálás:
a célspecifikus RNS szekvenálásban génspecifikus, génspecifikus, útspecifikus vagy betegséggel összefüggő transzkriptómák csoportja van szekvenálva.
A cél RNS szekvenálás megfizethetőbb és pontosabb, mint a teljes transzkriptóm szekvenálás. Ezenkívül kevesebb mennyiségű RNS-minta szükséges a kísérlet elvégzéséhez.
kis RNS szekvenálás:
az RNS-szekvenálás egyik leginkább felmerülő technikája egy sejt kisebb, nem kódoló RNS-jének tanulmányozása, mivel ezek a genomban oly sok funkcióval társulnak.,
a kisebb RNS-molekulák, például a miRNA, a siRNA és a piRNA számszerűsíthetők és szekvenálhatók az NGS-alapú RNS-szekvenálási módszerrel különböző alkalmazásokhoz.
mRNS szekvenálás:
Szekvenciálja a teljes mRNS átiratot a génexpressziós vizsgálatokhoz használt poli(a) farokkiválasztással. Az mRNS szekvenálás ismert, valamint az új átirat módosítása is kimutatható.
az RNS szekvenálás előnyei:
az RNS szekvenálás egyik legfontosabb előnye, hogy nincs szükség előzetes szekvenciainformációra., Mivel az egész folyamat nem a szonda alapú kémián alapul, itt nincs szükség előzetes szekvenciainformációra a szonda tervezéséhez.
pontosabb és érzékenyebb génexpressziós vizsgálatot lehet végezni.
szélesebb dinamikus tartomány.
rögzítse mind az ismert, mind az átirat új módosításait, még akkor is, ha nem áll rendelkezésre sorozatinformáció.
annak ellenére, hogy nem áll rendelkezésre referencia-szekvencia-információ, az RNS szekvenálás bármely fajra alkalmazható.
kapcsolódó: szintetikus Genom-módszerek, alkalmazások és kihívások.,
következtetés:
meggyőzően mondhatjuk, hogy az RNS seq módszer fejlettebb és pontosabb, mint a mikroarray. A De novo mutációk is felfedezhetők vele.