Descrizione
Gli RFLP sono bande che corrispondono a frammenti di DNA, di solito nell’intervallo di 2-10 kb, che sono il risultato della digestione del DNA genomico con enzimi di restrizione. Frammenti di DNA sono separati da elettroforesi su gel di agarosio e vengono rilevati mediante successiva ibridazione Southern blot ad una sonda DNA marcato. L’etichettatura della sonda può essere eseguita con un isotopo radioattivo o con macchie non radioattive alternative, come la digossigenina o la fluoresceina., Le sonde locus specific RFLP consistono in una sequenza omologa di una specifica regione cromosomica. Le sonde sono generate attraverso la costruzione di librerie di DNA genomico o complementare (cDNA) e quindi possono essere composte da una sequenza specifica di identità sconosciuta (DNA genomico) o parte della sequenza di un gene funzionale (solo esoni, cDNA). Le sonde RFLP sono mantenute come cloni in vettori batterici adatti che consentono convenientemente l’isolamento dei frammenti di DNA che detengono. Possono essere utilizzate sonde di specie affini (sonde eterologhe)., La variazione della sequenza del DNA che influenza l’assenza o la presenza di siti di riconoscimento di enzimi di restrizione e inserimenti e delezioni all’interno di due siti di restrizione adiacenti, costituiscono la base dei polimorfismi di lunghezza.
Punti di forza
Gli RFLP sono generalmente moderatamente polimorfici. Oltre alla loro elevata abbondanza genomica e alla loro distribuzione casuale, gli RFLP presentano i vantaggi di mostrare alleli codominanti e di avere un’elevata riproducibilità.,
Punti deboli
I principali inconvenienti di RFLPs sono il requisito di procedure metodologiche laboriose e tecnicamente impegnative e costi elevati. In generale, se la ricerca è condotta con gruppi di specie selvatiche scarsamente studiati o colture scarsamente studiate (colture orfane), potrebbero non essere ancora disponibili sonde adatte, quindi sono necessari investimenti considerevoli per lo sviluppo. Inoltre, sono necessarie grandi quantità di DNA purificato ad alto peso molecolare per ogni digestione del DNA. Grandi quantità sono necessarie per le specie con genomi più grandi, e per il maggior numero di volte necessarie per sondare ogni macchia., Gli RFLP non sono suscettibili di automazione e la collaborazione tra gruppi di ricerca richiede la distribuzione di sonde.
Applicazioni
RFLPs può essere applicato in diversità e studi filogenetici che vanno da individui all’interno di popolazioni o specie, a specie strettamente correlate. Gli RFLP sono stati ampiamente utilizzati negli studi di mappatura genica a causa della loro elevata abbondanza genomica dovuta all’ampia disponibilità di diversi enzimi di restrizione e alla distribuzione casuale in tutto il genoma., Essi sono stati utilizzati anche per indagare le relazioni di taxa strettamente correlati, come strumenti di impronte digitali, per gli studi di diversità, e per gli studi di ibridazione e introgressione, compresi gli studi di flusso genico tra le colture e le erbacce.
Lettura consigliata
Mappatura del polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione in conifere e applicazioni alla genetica forestale e al miglioramento degli alberi Neale, DB e Williams, CG (1991). Canadian Journal of Forest Research, 21: 545-554. doi: 10.1139 / x91-076.