Nachweis von Pneumocystis jiroveci in Atemproben mit vier Färbemethoden

Pneumocystis jiroveci, früher als Pneumocystis carinii bekannt, ist nach wie vor eine wichtige Ursache für Lungenentzündung bei immungeschwächten Patienten, obwohl Infektionen mit diesem Wirkstoff nach der weit verbreiteten Anwendung einer hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART) bei HIV-Infektionen (Human Immunodeficiency Virus) abgenommen haben (9, 12). Patienten, die aus anderen Gründen als einer HIV-Infektion immungeschwächt sind, haben ebenfalls ein Risiko für eine durch P verursachte Lungenentzündung., jiroveci, einschließlich Patienten mit hämatologischen Malignomen und Patienten, die Immunsuppressiva zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen erhalten haben (2, 11, 12).

Obwohl eine Vielzahl von Nukleinsäure-Amplifikationsassays, einschließlich Echtzeit-PCR-Assays, für den Nachweis von P. jiroveci entwickelt wurden, sind diese Assays in den meisten klinischen mikrobiologischen Labors nicht üblich und nicht kommerziell erhältlich (3, 5). Daher ist die wichtigste Labormethode für den Nachweis von P., jiroveci, ein Organismus, der nicht mit Standardmethoden kultiviert werden kann, ist die direkte visuelle Untersuchung der klinischen Probe nach einer Art Färbemethode (12). Eine Vielzahl von histochemischen Tests wurde verwendet, um Pneumocystis in klinischen Proben nachzuweisen. Diese histochemischen Flecken umfassen die Diff-Quik, Grocott-Gomori Methenamin Silber (GMS) und Calcofluor weiße Flecken. Diff-Quik-Fleck ist eine Modifikation von Wright Fleck (3). GMS-Fleck ist ein Silberniederschlagsfleck, der üblicherweise zur Visualisierung von Pilzen in histologischen Abschnitten verwendet wird (10)., Calcofluor White Stain ist ein fluoreszierender Fleck, dessen Wirkstoff Cellufluor ist, der unspezifisch an beta-gebundene Polysaccharide wie Chitin und Cellulose bindet und zur direkten Visualisierung von Pilzen in klinischen Proben verwendet wird (4). Immunfluoreszenzflecken, bei denen Antikörper gegen P. jiroveci eingesetzt werden, stehen auch zum direkten Nachweis dieses Organismus in klinischen Proben zur Verfügung (3, 5). Diese Flecken ähneln den direkten und indirekten Immunfluoreszenzflecken, die zum Nachweis von Viren in klinischen Proben verwendet werden., Jeder Fleck hat seine Befürworter; Vergleichsdaten in der HAART-Ära sind begrenzt.

Daher führten wir eine multiinstitutionelle Bewertung von vier häufig verwendeten Färbemethoden zum direkten Nachweis von P. jiroveci in klinischen Atemwegsproben durch. Die Dias aus untersuchten Atemproben, von denen die meisten bronchoalveoläre Lavageproben waren, wurden unter Verwendung von Zytozentrifugation hergestellt. Replikatabstriche von 313 Atemwegsproben, die zur P. jiroveci-Untersuchung eingereicht wurden, wurden auf das Vorhandensein von P. jiroveci mit dem Calcofluorweiß (Fungifluor; Polysciences, Inc.,, Warington, Pa.), GMS, Diff-Quik (Baxter Wissenschaftliche, McGraw Park, Ill.), und Merifluor Pneumocystis (Meridian Bioscience, Inc., Cincinnati, Ohio) Flecken. Dias wurden mit den Merifluor Pneumocystis-und Diff-Quik-Flecken gemäß den Anweisungen des Herstellers gefärbt. Für die Kalkofluor-Weißfärbung wurde jedem Objektträger 1 Tropfen Fungifluor zugesetzt, der Decklip so aufgebracht, dass das Reagenz den gesamten probenhaltigen Bereich bedeckte und der Objektträger vor der Interpretation mit einem Fluoreszenzmikroskop mindestens 10 min in einer dunklen Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur sitzen ließ., Für die GMS-Färbung wurden die Dias 40 s lang in einer 10% igen Chromsäurelösung mikrowavriert, mit Wasser gewaschen und dann 30 s lang mit 1% Natriummetabisulfit gereinigt. Nachdem die Dias mit destilliertem Wasser gewaschen worden waren, wurden sie in ein Coplin-Gefäß mit 50,0 ml Methenamin-Arbeitslösung gegeben und weitere 65 s mikrowavriert., Die Objektträger wurden erneut mit destilliertem Wasser gespült, 2 bis 5 s lang mit 1% Goldchlorid behandelt, mit destilliertem Wasser gespült, 1 min lang 5% Natriumthiosulfat ausgesetzt, mit einer hellgrünen Arbeitslösung gegengefärbt, in Xylol gereinigt, mit Deckgläsern bedeckt und routinemäßig untersucht Lichtmikroskopie.

Jedes der Laboratorien der vier teilnehmenden Institutionen führte einen der verschiedenen Flecken durch und machte seine Interpretationen basierend auf dieser Färbemethode., Die Personen in jeder Einrichtung hatten Erfahrung mit der dort durchgeführten Färbemethode und der Interpretation des Flecks. Die Proben erhielten eindeutige Identifikationscodes, und jeder Fleck wurde unabhängig untersucht, ohne Kenntnis des Ergebnisses, das durch eine andere Färbemethode an derselben Probe erhalten wurde., Die Probenmenge reichte selten aus, um alle vier Dias herzustellen; 308 Dias standen für die Färbung mit Calcofluor White zur Verfügung, 310 Dias standen für die Färbung mit Merifluor Pneumocystis zur Verfügung, 307 Dias standen für die Färbung mit Diff-Quik zur Verfügung und 310 Dias standen für die Färbung mit GMS zur Verfügung. In keinem der Fälle, in denen ein Objektträger aufgrund einer unzureichenden Probenmenge nicht verfügbar war, war die Kategorisierung dieses Objekts als wahres positives oder wahres Negatives (siehe unten) vom Ergebnis des fehlenden Objektträgers abhängig.,

Die Sensitivität, Spezifität sowie positive und negative Vorhersagewerte wurden mit Standardmethoden berechnet (Tabelle 1). Die Proportionen der wahr-positiven und falsch-positive Ergebnisse für Gepaarte tests verglichen wurden mit dem chi-Quadrat-test mit dem EpiCalc 2000 statistische software (www.brixtonhealth.com/epicalc.html).

Obwohl mehr true-positive Proben entdeckt wurden, die von der Merifluor Pneumocystis-Fleck, diese Zahl war nicht signifikant Verschieden von denen erkannt, die durch die Calcofluor white (P = 0.260) und GMS (P = 0.343) Flecken., In ähnlicher Weise unterschied sich die Anzahl der durch GMS-und Calcofluor-Weißflecken nachgewiesenen True-Positive-Werte nicht signifikant (P = 0,838). Die Anzahl der von Diff-Quik-Flecken nachgewiesenen True-Positive-Werte war jedoch signifikant geringer als die von Merifluor Pneumocystis (P = 0,002), GMS (P = 0,027) und Calcofluorweiß (P = 0,042). Die Zahl der Fehlalarme war nicht signifikant unterschiedlich zwischen den Calcofluor white, GMS, und Diff-Quik Flecken (jeder Vergleich hatte einen P-Wert von >0.05)., Die Anzahl der nach der Färbung mit Merifluor Pneumocystis stain gemeldeten Fehlalarme war jedoch signifikant größer als die nach der Färbung mit GMS (P = 0,004), Calcofluorweiß (P = 0,001) oder Diff-Quik (P = 0,001).

In einigen Fällen kann eine induzierte Sputumprobe die erste Probe sein, die zur Beurteilung des Vorhandenseins von Pneumocystis in der diagnostischen Aufarbeitung eines Patienten mit Lungenentzündung erhalten wurde, bei dem der Verdacht besteht, dass dieser Organismus verursacht wird (6)., Wenn eine induzierte Sputumprobe das ätiologische Mittel der Lungenentzündung nicht liefert, kann eine Probe aus der bronchoalveolären Lavage, die signifikant teurer ist und ein geringes Risiko für den Patienten birgt, benötigt werden, um diagnostisches Material zu erhalten., Aufgrund der Unterschiede in der Behandlung von Lungenentzündung durch Pneumocystis im Vergleich zu Lungenentzündung durch andere Mikroorganismen und der möglichen Notwendigkeit einer Bronchoskopie, die zusätzliche Kosten und Risiken für den Patienten verursacht, ist es für den Fall, dass keine Diagnose gestellt wird, wichtig, dass die bestmögliche Färbemethode für den Nachweis dieses Organismus verwendet wird.,

Darüber hinaus ist die Bedeutung einer empfindlichen und spezifischen Färbemethode im Zeitalter von HAART besonders wichtig, da die geringere Prävalenz einer durch Pneumocystis verursachten Lungenentzündung den positiven Vorhersagewert eines Assays mit einer Spezifität von weniger als 100% beeinträchtigt % (9). Obwohl die Prävalenz einer Pneumonie, die durch Pneumocystis verursacht wird, in der HAART-Ära anders ist als in der Pre-HAART-Ära, ist die Wahl der optimalen Färbemethode zum Nachweis von Pneumocystis auch für Patienten mit anderen immungeschwächten Erkrankungen wichtig, bei denen ein Infektionsrisiko besteht., Tatsächlich kann die Wahl der optimalen Färbemethode für den Nachweis von Pneumocystis bei nicht HIV-infizierten, immungeschwächten Patienten wichtiger sein, da gezeigt wurde, dass Atemproben dieser Patienten eine geringere Belastung durch Organismen aufweisen als diejenigen von HIV-infizierten, immungeschwächten Patienten (6).

Nach unserer Erfahrung war der Diff-Quik-Fleck aufgrund der geringen Empfindlichkeit und des negativen Vorhersagewerts dieses Flecks kein wirksames Mittel zum Screening auf das Vorhandensein von P. jiroveci (d. H. Einer primären Färbemethode). Deutlich mehr Exemplare, die P enthielten., jiroveci wurde bei der Diff-Quik-Methode übersehen als bei Calcofluor white, Merifluor Pneumocystis und GMS. Raab et al. beschreiben Sie auch sowohl eine geringe Empfindlichkeit (68%) als auch eine geringe Spezifität (88%), wenn der Diff-Quik-Fleck allein zum Nachweis von Pneumocystis und anderen Pilzen in bronchoalveolären Lavageproben verwendet wurde (10). Diese Ergebnisse stehen jedoch im Gegensatz zu denen anderer Gruppen, die berichtet haben, dass die Diff-Quik-Methode mit der GMS-Färbemethode zum Nachweis von Pneumocystis vergleichbar war (7, 8)., Eine Gruppe berichtete, dass die Diff-Quik-Methode empfindlicher war als Kalkofluoreszenz, direkte Immunfluoreszenzfärbung und sogar PCR, aber diese Ergebnisse wurden nicht bestätigt (1).

Umgekehrt war der Merifluor Pneumocystis-Fleck die empfindlichste Färbemethode und kann sich als Bildschirm als nützlich erweisen, um das Vorhandensein von Pneumocystis auszuschließen, aber es war die am wenigsten spezifische Methode in dieser Studie. Die Anzahl falsch positiver Ergebnisse mit dem Merifluor Pneumocystis-Fleck war jedoch signifikant größer als die für jeden der anderen Flecken gemeldeten., Die Merifluor Pneumocystis-Studie hatte einen positiven Vorhersagewert von nur 81,9% im Vergleich zu den anderen drei Methoden, die alle positive Vorhersagewerte von mehr als 96% aufwiesen. Ng et al. haben auch scheinbare falsch-positive Ergebnisse mit diesem Färbeverfahren beschrieben (8). Daher schlagen wir vor, dass, wenn Merifluor Pneumocystis als primäre Färbemethode in einem klinischen mikrobiologischen Labor verwendet wird, eine Bestätigung mit einer zweiten Methode durchgeführt werden sollte, um die Spezifität und den positiven Vorhersagewert des endgültigen Testergebnisses zu erhöhen.,

Die Empfindlichkeiten sowohl der Calcofluorweiß-als auch der GMS-Flecken lagen zwischen denen der Diff-Quik-und Merifluorpneumocystisflecken, waren jedoch hochspezifisch und wiesen positive prädiktive Werte über 96% und negative prädiktive Werte über 93% auf. Fraire et al. haben auch die Kalkofluor-Weiß-und GMS-Flecken als vergleichbar für den Nachweis von Pneumocystis beschrieben, mit 92,6% Konkordanz (4). Baughman et al., (1a) beschreiben Sie auch die Empfindlichkeit eines indirekten immunfluoreszierenden Antikörperflecks, der auf Pneumocystis gerichtet ist und im Vergleich zu einem modifizierten Wright-Fleck und einem GMS-Fleck eine höhere Empfindlichkeit aufweist, aber sie berichteten über ein einziges falsch positives Ergebnis und daher eine viel höhere Spezifität als wir beschreiben. Es ist möglich, dass man mit zusätzlicher Übung die pathognomonischen Formen mit dem Diff-Quik-Fleck leichter erkennen kann, wodurch die Empfindlichkeit dieses Assays erhöht wird., In ähnlicher Weise könnte man vielleicht mit zusätzlichen Erfahrungen mit dem Merifluor Pneumocystis-Fleck lernen, zwischen wahr-positiver und falsch-positiver Färbung besser zu unterscheiden und dadurch die Anzahl falsch-positiver Ergebnisse zu verringern.

Nach unserer Erfahrung haben die Calcofluor White-und GMS-Flecken die besten Parameter für den Routineeinsatz in einem klinischen Labor. Obwohl diese Assays weniger empfindlich waren als der Immunfluoreszenz-Assay, waren sie hochspezifisch und hatten mehr als akzeptable positive und negative prädiktive Werte.,

• Copyright © 2004 American Society for Microbiology