GLP-1 OG INSULIN SEKRESJON
Oversikt over de ATP-sensitive veien.
Glukose-stimulert insulin sekresjon (GSIS) er regulert av en rekke ioniske og ikke-ionisert signaliserer veier, også kjent som KATP-avhengige og uavhengige trasé (34,35). Den KATP-avhengige mekanisme av stimulus-sekresjon kopling er gjennomgått i Fig. 1., Generelt, β-celle tilpasser insulin sekresjon til gjeldende blod glukose nivå gjennom glukose metabolisme. Når blodsukkeret stiger, frekvensen av glykolysen øker, noe som genererer underlag (hovedsakelig pyruvate) for mitokondrie oksidativ metabolisme, resultatet er produksjon av ATP, eller mer korrekt en økning i ATP til ADP-forhold (36). Denne hendelsen gir funksjonell kobling mellom en glukose stimulans og insulin sekresjon., Økningen i dette forholdet fører til nedleggelse av β-celle KATP-kanaler, noe som fører til plasma membran depolarization, aktivering av spenning avhengige av Ca2+ – kanaler (VDCCs), og en økning i den intracellulære konsentrasjonen av Ca2+ (jeg), er den viktigste trigger for insulin sekresjon. Repolarization av β-cellene er sannsynlig mediert av spenning avhengig K+ (Kv) – tv og Ca2+-sensitive spenning avhengig K+ (KCa) tv (37), som åpner i respons til glukose-indusert membran depolarization å gjenopprette den ytre forandring av K+., GLP-1 er foreslått å modulere GSIS ved å regulere aktiviteten til flere ion-tv involvert i KATP-avhengig av insulin sekresjon samt trinnene distale til kanal modulasjon.
GLP-1 og β-celle KATP-kanaler.
En av de mange observerte cellulære effekter av GLP-1 er hemming av β-celle KATP-kanaler (38-40). Den resulterende membran depolarization indusert av KATP-kanal nedleggelse starter Ca2+ strøm gjennom VDCCs og utløser exocytotic frigjøring av insulin., Figur 2 viser excitatory effekten av GLP-1 på membran potensial og sin hemmende effekt på både innfødte KATP-kanal strøm fra INS-1 celler og strøm mediert av rekombinant KATP-kanaler (SUR1/Kir6.2) coexpressed med GLP-1 reseptor i et pattedyr cellelinje. De fysiologiske konsekvensene av GLP-1-tilrettelagt KATP-kanal nedleggelse ville være å 1) øke excitability av celler som allerede er over terskelen for insulin utslipp og 2) øke andelen av β-cellene aktivt insulin sekresjon på glukose konsentrasjoner som normalt subthreshold for frigjøring av insulin.,
Det generelle synet er at den hemmende effekten av GLP-1 på KATP-kanaler, cAMP/PKA-avhengige (38-41), selv om en studie med rotte β-celler er uenig (42). Denne påstanden ved å Suga et al. (42) er basert på å finne den spesifikke PKA-hemmer Rp-leire (100 µmol/l) var i stand til å hindre mobil depolarization og reduksjon i hel-celle KATP gjeldende fremkalles av GLP-1. Fullstendighet av PKA hemming av Rp-leirene skal være avhørt fordi i den samme studien, forskolin indusert betydelig insulin sekresjon selv i nærvær av Rp-leirene. For det andre, Suga et al., foreslår at GLP-1 fører til en svak økning i ATP-følsomhet av KATP-kanal slik at ved lave micromolar ATP konsentrasjoner, den KATP-kanal vil være mer utsatt for nedleggelse. Imidlertid, i vanlig rotte bukspyttkjertelen beta-celle, millimolar nivåer av ATP er til stede (43), og på disse fysiologiske ATP nivåer, svært lik KATP-kanal åpne sannsynlighet (Po) i fravær og tilstedeværelse av GLP-1 er spådd som følger. Våre beregninger viser at med en intracellulære av 2 mmol/l, den KATP-kanal Po er redusert fra 0.005 å 0.003 i nærvær av GLP-1., Det er grunn til å anta at et venstre skift av ATP-følsomheten ikke skje i nærvær av GLP-1. Imidlertid observert omfanget av GLP-1-indusert KATP gjeldende reduksjon sett i hele cellen patch-clamp-opptak (Fig. 2) er trolig for stor til å bli gjort utelukkende av små reduksjoner i Po beregnet ut fra data om Suga et al. (42). Siste arbeider fra vårt laboratorium har vist at membran-permeant bestemt PKA-hemmer H-89 (44) er i stand til helt å hemme KATP gjeldende reduksjon av GLP-1 (45)., Videre, andre har vist lignende resultater som ved bruk av Rp-8-Br-leire, en mer membran-permeable analog av Rp-leire (38,41). Tiltak for GLP-1 på KATP-kanaler, kan også innebære andre signaliserer trasé fordi KATP-kanal hemming av GLP-1 i mus β-cellene ble vist seg å være calmodulin avhengig av, ved hjelp av calmodulin-hemmere W-7 og calmidazolium (46).
glukose avhengighet av GLP-1-handlinger har blitt godt etablert, selv om de nøyaktige mekanismene for denne avhengigheten er uklart (41,47)., Men, det cellulære handlinger av PKA på KATP-kanal kan gi en kobling mellom denne kinase og glukose følsomhet av GLP-1. Andre grupper har vist at tillegg av katalytisk subunit av PKA (cPKA) til excised lapper som inneholder KATP-kanaler resulterer i en styrking av KATP gjeldende (39,48). Vårt laboratorium har nylig vist at effekten av cPKA på KATP aktuell er avhengig av ADP (45). Når ADP-nivåer er forhøyet, cPKA øker KATP-kanal gjeldende i et rekombinant system, i samsvar med resultatene av Lin et al. (39)., I motsatt fall, som ADP-nivåene er redusert, cPKA reduserer KATP gjeldende (45). Fysiologisk, kan dette resultere i en ubetydelig utvidelse av β-celle oppstemthet når blodsukkeret er lav (høy ), mens når blodsukkeret stige (lav ), GLP-1-mediert nedleggelse av KATP-kanaler, via en PKA-avhengige vei, fører til membranen depolarization og påfølgende økning i β-celle oppstemthet., Spesiell oppmerksomhet må gis til mobil ATP til ADP-forhold når de vurderer KATP-kanal aktivitet fordi det er endringer i dette forholdet, mer enn bare endringer i intracellulære per se, som regulerer aktiviteten av KATP-kanaler i intakt β-celle. Gratis ATP er svært bufret i cellen av membran og cytosolic ATPases (43) og er spådd ikke å endres vesentlig med økt glukose metabolisme (36). I kontrast, den gjensidige endring i ADP, som er ikke-bufret i samme grad, er mer betydelig og resulterer i en endring i ATP til ADP-forhold (36)., Faktisk, betydningen av ADP i å kontrollere β-celle KATP-kanal aktivitet har vist seg fordi mutasjoner i ADP-sensing område av human KATP-kanal føre til ukontrollert insulin sekresjon og hypoglykemi (49). Den molekylære identitet av PKA phosphorylation område(r) som er av vesentlig betydning og er fortsatt under etterforskning. Både Kir6.,2 og SUR1 underenhetene av KATP-kanalen inneholder antatte målet sekvenser for PKA-mediert phosphorylation (39,48), og systematisk mutasjon av disse restene bør avklare den relative bidrag av disse nettstedene for å virkningen av PKA på KATP-kanal.
GLP-1, VDCCs, og intracellulære Ca2+ – butikker.
GLP-1 har vist seg å forbedre strøm gjennom VDCCs i mus, rotte og menneske β-celler (38,50–52), selv om omfanget av denne effekten varierer og gjør ofte ikke kommer til å nå statistisk signifikans., I enkelt menneske β-celler, GLP-1 ble vist å øke L-type VDCC aktivitet og amplitude av depolarization-vakte intracellulære kalsium transienter, en effekt som sto for 40% av økningen i GLP-1-kraftig exocytosis (52). Selv om L-type VDCCs er klassisk ansett som den store regulatorer av Ca2+ strøm fører til insulinutskillelse, β-cellene er kjent for å uttrykke flere Ca2+ – kanal isoforms (53). Pereverzev et al. (54) rapporterte nylig at mus som mangler a1E-isoformen av Cav2.3 har redusert glukosetoleranse og redusert insulin svar til glukose., De spekulerer i at G-protein regulering av denne kanalen kan modulere insulin sekresjon basert på muskarine acetylkolin reseptor regulering av VDCCs in vitro (55).
Vi har funnet i HIT-T15 insulinoma celler transfekte med GLP-1 reseptor at GLP-1 fører til en økning i spenning avhengige av Ca2+ strøm (se 56 og Fig. 3A). Dette skyldes, i hvert fall delvis, til et venstre skift i spenning avhengighet av aktivering minner om effekten av VDCC phosphorylation av PKA (57,58)., Vi har også observert en push mot høyre skift i spenning avhengighet av steady-state inaktivering slik at i nærvær av GLP-1, mindre tv var effektivt inaktiverte på et gitt holde potensial (50). Dette støttes av Britsch et al. (50), som tyder på at GLP-1 behandling av musen β-celler bremser inaktivering av spenning avhengige av Ca2+ strøm. I tillegg, GLP-1 førte til en økning i intracellulære kalsium kun etter at glukose tillegg, en effekt som ble blokkert i en del av VDCC antagonister (Fig. 3C)., Evne til GLP-1 for å forbedre Ca2+ strøm er, som effekten på KATP-kanaler, cAMP-avhengig (51,52), basert på evnen til Rp-leiren for å hindre en økning i strøm. Faktisk, behandling av rotte β-celler med dibutyryl syklisk-AMP, en membran-permeable cAMP analog, replikeres effekten av GLP-1 på Ca2+ strøm (51)., I tillegg, i våre studier (56), den VDCC svar til GLP-1 ble tapt i HIT-T15-celler uttrykker en mutant GLP-1 reseptor mangler kritisk rester som kreves for kopling til adenylyl cyclase, mens VDCC aktivitet kan fortsatt forbedres ved leiren uavhengig agonist BAYK8644. Nyere data tyder på at et En-kinase forankring protein (AKAP), AKAP18, mål PKA å VDCCs og at dette kinase kan være involvert i GLP-1 modulering av disse kanalene (59).,
I tillegg til effekter på VDCCs, GLP-1 kan mobilisere intracellulære kalsium butikker i en cAMP-avhengig måte (60,61), muligens bidra til oscillatory jeg svar til GLP-1 sett i HIT-T15-celler (Fig. 3C) (62). Våre studier tyder på at GLP-1-programmet resulterer i svingninger i i i HIT-T15-celler, og at disse svingninger er ikke avskaffet (selv om de er redusert i amplitude) ved fjerning av ekstracellulære Ca2+, eller ved VDCC blokade (Fig. 3C)., Faktisk, i en rekke celletyper, Ca2+ svingninger forårsaket av en agonist er først og fremst forårsaket av Ca2+ slipper gjennom inositol trisphosphate (IP3) og/eller ryanodine-sensitive butikker (63-65). I β-celler, GLP-1 mobilizes Ca2+ – butikker i store deler av allergifremkallende den ryanodine receptor (sannsynligvis type 2 isoformen, RYR-2) til prosessen av Ca2+-indusert Ca2+ release (CICR) (61,66). Flere studier har vist at GLP-1 kan øke eg i PKA-uavhengig måte (67-69)., Denne mekanismen har nylig blitt tilskrevet CICR fra ryanodine-sensitive butikker via cAMP-regulert guanin nukleotid exchange faktor II (GEF-II eller Epac2) og dets interaksjon med enten Ras-relaterte liten G-protein Rap1 eller med Rab3 liten G-protein effector Rim2 (68). Betydningen av cAMP-GEF-II-Rim2 har blitt påvist, fordi virkningen av dette komplekse (ved antisense oligonukleotider eller mutant konstruksjoner) utvannet den secretory svar av musen holmer eller MIN6 insulinoma celler til GLP-1 (67)., Fordi affinitet av leir for PKA er mye høyere (∼100 nmol/l) sammenlignet med cAMP-GEF-II (∼10 mmol/l), er det interessant å spekulere i at GLP-1-stimulert cAMP-GEF-II veien kan operere på en økning i lokal cAMP snarere enn globale endringer., Selv om GLP-1 reseptor-signalering brukes stimulerer IP3 produksjon i GLP-1 reseptor-å uttrykke COS celler (70), en rolle for IP3-sensitive Ca2+ – butikker i global jeg er i tvil fordi GLP-1-stimulert IP3 produksjon i primær-β-celler er angivelig minimal (71,72) og IP3-reseptor antagonist xestospongin C ikke klarte å blokkere utgivelsen av intracellulære Ca2+ butikker av forskolin behandling (68). Imidlertid, IP3-regulert Ca2+ utgivelsen fra insulin granulater har vært foreslått av studier av Nakagaki et al., (62), som tyder på at GLP-1 unikt regulere temporal og spatial utgivelsen av intracellulære kalsium gjennom lokale IP3 signalering. Dermed, GLP-1-mediert utgivelsen av intracellulære butikker, sammen med potentiation av Ca2+ oppføringen gjennom VDCCs, trolig bidra til insulinotropic effekten av GLP-1.
GLP-1 og β-celle Kv-tv.
Spenning avhengig K+ strømmer, slik som de formidlet av Kv eller KCa-tv, megle repolarization av β-cellene etter en depolarizing stimulus, for eksempel glukose (37)., Nylig rapporterte vi at og Kv1 Kv2 familie-tv regulere insulin sekresjon, fordi dominerende negative funksjonelle knockout av en av disse kanal familier forbedret GSIS (73). Kv2.1 tv megle fleste av denne effekten (>60%), mekanismen som innebærer forbedret glukose-stimulert membran depolarization og Ca2+ oppføring (upubliserte observasjoner). Fordi β-celle Kv strømmene er potent glukose-avhengige regulatorer av insulin sekresjon, har vi en hypotese om at fysiologiske secretagogues, for eksempel GLP-1, kan regulere Kv-kanal., Ja, vi rapporterer andre steder i dette tillegget at GLP-1 reseptor agonist exendin 4 hemmer spenning avhengige av ytre K+ strømmer i rotte β-celler spenning-festet i hel-celle-konfigurasjon med 40% og betydelig forlenger tiden løpet av β-celle repolarization etter forbigående depolarization av gjeldende injeksjon. Sammenligner denne med en 86% reduksjon i ytre K+ strømmer oppnådd med den generelle Kv kanal antagonist tetraethylammonium. GLP-1 bekjempet spenning avhengige av ytre K+ strømmer i rotte β-celler i fravær av glukose., Imidlertid er denne effekten kan likevel bidra til glukose avhengighet av GLP-1 insulinotropic effekt, fordi Kv-tv er normalt ikke forventes å være aktive før etter en glukose-indusert depolarization av cellemembranen (37). I tillegg, og lik effekten av GLP-1 på den andre ion-tv nevnt ovenfor, exendin 4-mediert hemming av β-celle Kv-tv er avhengig av cAMP signalering. En fersk studie, men foreslo at leiren signaliserer var ikke i seg selv tilstrekkelig til å motvirke spenning avhengig K+ strømmer i en insulin-sekresjon cellelinje (INS-1) (74).,
Tallrike studier har beskrevet effekter på hormon-mediert endringer i spenningen avhengig K+ strømmer, både excitatory og hemmende. De beste preget av disse effektene er spenningen avhengig K+ gjeldende downregulation i lymfocytter og upregulation i cardiac myocytes (75,76). I begge disse vev, cAMP/PKA signaliserer veien har vært innblandet i reguleringen av disse kanalene (76,77)., Rapporter tyder på at leiren kan redusere spenning avhengig K+ strømmer i murin lymfocytter (76) og en hypofysen cellelinje (78), men øke spenningen avhengig K+ strømmer i cardiac myocytes (77), et funn som har blitt bekreftet på singel-kanalen nivå i frog atrial myocytes (79) og kjempeblekksprut axon (80)., Phosphorylation kan oppstå direkte på kanalen, fordi PKA phosphorylation av en atrial Kv-kanal nær NH2-terminus kanal med forbedret aktivitet (81), og phosphorylation av Kv1 kanal α-underenhetene regulerer omfanget av hemming av disse kanalene gitt av en regelverks-β-subunit (82). Phosphorylation av β-underenhetene kan også selv modulere regulatory interaksjon med pore-forming α-underenhetene (83). Det har nylig blitt vist at regulering av en hjerte-Kv-kanal (KvLQT) av cAMP krever uttrykk for AKAP15/18 eller AKAP79 (84)., I tillegg, en økning i spenning avhengig K+ gjeldende er innblandet i adrenalin-indusert hemming av glukose-avhengige økning i jeg i ob/ob og +/+ mus β-celler (85) siden effekten ble reversert av tetraethylammonium. Det er interessant at den hemmende effekten av epinephrine på jeg også ble reversert av den adenylyl cyclase aktivator forskolin (85). Derfor tror vi det er montering tyder på at hormonelle modulering av Kv strøm er fysiologisk viktig. Spesielt, GLP-1 hemming av disse strømmene er forventet å føre til økt β-celle oppstemthet.,
GLP-1 og andre β-ion celle-tv.
Øker i intracellulære leiren har lenge vært kjent for å forbedre Na+ strømmer (86), en effekt som kan være mediert gjennom direkte kanal phosphorylation av PKA (87). En forbigående Na+ gjeldende svar til leiren ble først beskrevet i gastropod nevroner og betegnet INa(cAMP) (88)., I insulin sekresjon celler, RNA uttrykk for ikke-selektive cation gener mSTRPC4 og LTRPC2 har nylig blitt oppdaget i insulinoma celler og menneskelige holmer, henholdsvis (89), og leiren har blitt rapportert til å indusere genuttrykk av mNSC1, som blir en mus uspesifikke kation-kanal (NSCC) (90). GLP-1 er tenkt å styrke en NSCC bærer hovedsakelig Na+ strømmer (91,92). Denne effekten oppstår gjennom GLP-1 aktivisering av cAMP signalering og utslipp av intracellulære Ca2+ butikkene og kan også tjene som ennå er en annen viktig regulerende veien for GLP-1 i β-celler (40)., Det er ikke klart om NSCCs aktivert av GLP-1 svarer til ikke-selektive cation gjeldende produsert ved aktivering av Ca2+-sensing reseptor (93), men sistnevnte effekt er rapportert å ikke involvere aktivering av Gs subunit, og kan derfor ikke innebære cAMP/PKA veien.
Det er lite kjent om effekten av GLP-1 på andre ion-tv. Celle-hevelse-aktivert Cl− strømmen har blitt oppdaget i insulin sekresjon celler (94), men en rolle for disse kanalene i insulin sekresjon er uklart., Cl− tv eksempel cystisk fibrose transmembrane konduktans regulator og utad rette Cl− tv er aktivert av cAMP/PKA signalering (95). Hvis forekommende i β-celler, vil denne effekten har en tendens til å fremme depolarization. En rapport tyder på at GLP-1, aktiveres en Ca2+-sensitive Cl− gjeldende i Xenopus dem å uttrykke GLP-1 reseptor (96), en effekt som var avhengig av Moduler(1,4,5)P3-avhengige intracellulære Ca2+ mobilisering (96). Det er fortsatt ikke bestemt, men om GLP-1 kan stimulere Cl− strømmer i insulin sekresjon celler.
GLP-1 og exocytosis.,
Glukose kan utøve en stimulerende effekt på insulin exocytosis, uavhengig av sin godt-preget handlinger initiert av hemming av KATP-kanaler. Betydningen av denne veien kan i en del realiseres ved at mus med en målrettet avbrudd i KATP (Kir 6.2 eller SUR1) vises ikke overt misdannelser i glukosetoleranse (97,98). KATP-uavhengig av insulin sekresjon er ikke godt forstått og er tenkt å involvere flere signaler som fungerer på ikke-ionisert mål, spesielt den distale trinn av exocytosis., Det har vært foreslått at glukose metabolisme er nødvendig for dette stimulerende effekt, og som sannsynligvis signaler ATP, cAMP, glutamat, og malonyl-CoA (rev. i 99 og 100). Gitt at ATP, leir, og PKA er alle involvert i exocytotic prosessen, er det plausibelt å tro at GLP-1 kan ha virkninger distalt for handlinger på ion-tv, ytterligere forbedring av insulin sekresjon. Det er vel kjent at handlinger som hemmer GLP-1-indusert cAMP akkumulering og PKA aktivering hemme insulinutskillelse, noe som tyder på at leiren og/eller PKA er det grunn til å anta effektorer (101)., I mus β-celler, bare en brøkdel av exocytosis kan forklares av handlinger på stimulus-sekresjon kopling (102). Fra studier som viser at leiren induserer sekresjon i nærvær av lav og høy jeg, det er antydet at leiren sensitizes exocytotic maskiner. Studier med photoreleasable cAMP og PKA-hemmere, viser at leiren vekker PKA-avhengige og uavhengige effekter på exocytosis. Øker i leiren, uavhengig av PKA aktivering, ser ut til å akselerere exocytosis av lett åpningsbar basseng i β-celler (103)., PKA-avhengige mobilisering av secretory granulater, i motsetning til den generasjon av leiren selv, ser ut til å kreve glukose metabolisme (økt ATP/ADP) og innebærer translocation av granulater (103,104). En slik effekt ville øke størrelsen på lett åpningsbar basseng, øke frekvensen av påfyll av bassenget, og forbedre exocytosis. Fordi GLP-1 kan øke både cAMP og PKA, effekter på exocytosis kan være underforstått fra disse dataene., Det er flere potensielle målet proteiner for handlinger av GLP-1, inkludert β-celle løselig N-ethylmaleimide-sensitiv faktor vedlegg protein reseptor (TROMMER) proteiner (105).
GLP-1 og intracellulære energi homeostase.
Nylige studier i clonal β-celler tyder på at insulinotropic handlinger av GLP-1 er delvis mediert av en PKA-avhengig av stimulering av hormon-sensitiv lipase (HSL) (106). Det er foreslått at lipolytic handlinger av GLP-1 forårsake nedbryting av trigycerides til frie fettsyrer i β-celler, som deretter konverteres til en long-chain-CoA., En økning i frie fettsyrer kan gi underlag for mitokondrie oksidasjon og ATP produksjonen, noe som fører til en større økning i de intracellulære ATP til ADP-forhold og ytterligere hemming av KATP-kanaler. I tillegg, fordi ATP kan i seg selv påvirke exocytosis, noen av handlingene til GLP-1 kan være å målrette den distale trinn av exocytosis, som nevnt ovenfor. Det har vært vist i flere studier at ATP markant forenkler exocytosis uavhengig av mobilnettet depolarization men er avhengig av Ca2+ (99)., Dermed er ennå en annen mulig mekanisme kan forklare GLP-1-indusert insulin sekresjon.