Celle linjer
HEK 293T cellelinje ble innhentet fra American Type Culture Collection (ATCC CRL-3216). Mus hybridom celle linjer KT13 og KT22 ble innhentet fra Utviklingsmessige Studier Hybridom Bank (DSHB). Begge cellelinjene ble avsatt til DSHB av Kazumasa Takeda og Asako Sugimoto (DSHB hybridom produkter KT13 og KT22)., Mus hybridom cellelinje 5E4/1F1 ble velvillig gitt av Miha Kosmač og Vladka Čurin Šerbec (University of Ljubljana). HEK 293T og hybridom cellene ble dyrket i DMEM (Gibco) supplert med 13% FBS (Gibco), 1× Penicillin/Streptomycin (Thermo Fisher), og 1× GlutaMAX (Gibco). Antistoff HC og LC-sekvenser fra individuelle hybridomas ble fastsatt ved revers transkripsjon polymerase chain reaction (RT-PCR) og kapillær sekvensering (Eurofins Genomics).,
Cycloheximide behandling og mikrosomer forberedelse
Alle pipettering trinn ble utført på isen og sentrifugering ble gjennomført ved 4 °C ved hjelp av en Eppendorf 5810R sentrifuger med fast vinkel rotoren F-45-30-11. Protein LoBind 1,5 mL sentrifugerør (Living) ble brukt for å minimere celle adhesjon til røret vegger. HEK 293T celler (1 million), mus hybridom celler (1 million av 5E4, KT13, og KT22 celler blandet i forholdet 1:1:1), AIR-77 leukemi celler (ATCC CRL-1621, 1 millioner), eller fersk isolert menneskelige CD19+ B-celler fra pre – og post Td-booster immunisering prøver (1.,5 millioner kroner hver) ble resuspendert i 1 mL PBS med 50 µg/mL cycloheximide og inkubert i 10 min til stall ribosomes med tilhørende messenger RNAs (mRNA) på grov endoplasmic reticulum. Cellene ble pelletert med 300 g i 10 min ved 4 °C og resuspendert ved pipettering 15× opp og ned i 120 µL høy tetthet lyse buffer (25 mM HEPES-KOH pH 7.2, 110 mM kalium acetat, 5 mM magnesium acetat, 1 mM EGTA, 25% sukrose , 5% litium laurylsulfat, 1 mM 1,4-ditiotreitol, 1× komplett EDTA-gratis protease inhibitor cocktail , 0,1 mg/mL cycloheximide, 0.015% digitonin, og 400 U/mL RiboLock RNase-hemmer )., Celle-og organell lyse ble fullført ved inkubering i 10 min på is. Hver homogenate var delt i to, 55 µL delprøver og overført til to ferske Protein LoBind rør. Rørene var sentrifugerte på 600 g, 3 min ved 4 °C til pellet kjerner og celle rusk. Av en total av 40 µL supernatant fra hvert rør, membran som inneholder brøker og cytosol, ble overført til frisk Protein LoBind rør og sukrose konsentrasjon ble fortynnet 0,37–0,40 M (12-13% w/w) med tillegg av 40 µL nuclease-gratis vann. Mikrosomer så ble sedimentert ved sentrifugering med 20,800 g for 120 min ved 4 °C., Den cytosol-inneholder supernatants ble forkastet og membran pellets ble resuspendert ved pipettering 10× opp og ned i 85 µL vaskebuffer (25 mM HEPES-KOH pH 7.2, 110 mM kalium acetat, 2,5 mM magnesium acetat, 1 mM EGTA, 1 mM 1,4-ditiotreitol, 1× komplett EDTA-gratis protease inhibitor cocktail, 0,1 mg/mL cycloheximide, 0.004% digitonin, og 400 U/ml RiboLock RNase-hemmer). Den mikrosomer ble sedimentert igjen ved sentrifugering med 20,800 g i 60 min ved 4 °C., Supernatants ble forkastet og mikrosomer pellets ble resuspendert i 20 µL vaskebuffer og holdes på is inntil videre bruk.
Transmisjon elektron mikroskopi
Eksempel alikvoter av 3.5 µL av resuspendert HEK 293T mikrosomer ble brukt til frisk glød-utladet Quantifoil nett (Quantifoil, Tyskland) dekket med en ekstra 2 nm karbon støtte film og flash-frosset i flytende etan ved hjelp av en Vitrobot stempelet (FEI). Prøvene ble fotografert på en Tecnai Ånd transmission electron microscope (FEI) operert på 120 kV utstyrt med en 2 × 2 k Eagle CCD-kamera (FEI)., Mikrografer ble registrert under cryo lav-dose i forhold til 42,000× nominell forstørrelse (pixel-størrelsen på objektet skala: 5.2 Cbl/px) søker en uskarp av − 2 − 4 µm. Innsamling av Data ble utført enten manuelt eller helt automatisk ved hjelp av Leginon .
Emulsjon RT-PCR montering ved hjelp av musen hybridom mikrosomer
Vi utvannet 16 µL av resuspendert mikrosomer fra blandet hybridomas 5E4, KT13, og KT22 i 184 µL RT-PCR master mix inneholder 1× Verso 1-Trinn RT-PCR master mix (Thermo Scientific), 1× Verso enzym blanding (Thermo Scientific), 0.,5 µg/µL BSA, 100 µg/mL cycloheximide, og primere for revers transkripsjon og HC og LC-montering (0.8 µM hver av primere TitA_MID1_IgM_rev og TitB_MID12_IgK_rev; 0.16 µM hver av primere OE_MHV_fwd og OE_MKV_fwd). Primer sekvenser er vist i annen fil 1: Figur S1a. Den resulterende 200 µL av vandig oppløsning ble brukt til å danne vann-i-olje emulsjon av dropwise tillegg (13 alikvoter av 15 µL i 30-s intervaller) til 800 µL olje fase i henhold til Ge et al. (Mineralolje, Sigma M5904, med 4.5% Span 80, Sigma S6760, 0.4% Tween 80, Sigma P8074, og 0.,05% Triton X-100, Sigma T8787) under kontinuerlig røring på en magnetrører., Seks alikvoter av 100 µL hver av de resulterende emulsjon ble overført til PCR-rørene og utsatt for thermocycling med følgende betingelser: revers transkripsjon ved 50 °C i 15 min, RTase inaktivering ved 95 °C i 2 min, og deretter fire sykluser av denaturering ved 95 °C for 20 s, avspenning rampdown fra 60 °C til 50 °C til 50 s og forlengelse ved 72 °C i 1 min, deretter 16 sykluser av denaturering ved 95 °C for 20 s, annealing ved 60 °C i 30 sekunder og forlengelse ved 72 °C i 1 min, etterfulgt av en siste utvidelse trinn ved 72 °C i 5 min., I parallell, en åpen RT-PCR-kontroll ble utført ved å fortynne 4 µL av resuspendert mikrosomer i 46 µL RT-PCR master mix og thermocycling reaksjonen parallelt med emulsjon RT-PCR. PCR-montering produktene ble pakket ut fra emulsjonen ved hjelp av isobutanol (2-Metyl-1-propanol, Sigma) og Zymo DNA Rent & Konsentrator-5 kit (Zymo Forskning) som tidligere publisert . Den resulterende DNA og PCR-produktet fra den åpne PCR-kontroll ble lagt på en 1,2% TBE-agarosegel og atskilt med 90 V i 60 min., Montering produkter av 800-950 bp størrelse var en størrelse som er valgt fra agarosegel og produkter ble funnet ved hjelp av en Zymoclean Gel DNA-Recovery-kit. Montering produkter var eluted i 6 mM Tris-Cl pH 8 og lagret ved − 20 °C til videre analyse.,
Nestede PCR-amplifikasjon av musen hybridom montering produkter
Etter emulsjon montering reaksjon, montering produkter ble ytterligere forsterket med adapter primere TitA_fwd, 5′ CGT ATC GCC TCC CTC GCG CCA TCA G 3′, og TitB_rev, 5′ CTA TGC GCC TTG CCA GCC CGC TCA G 3′, ved hjelp av Phusion high-fidelity DNA-polymerase kit (Finnzymes) med følgende thermocycling betingelser: Første denaturering på 98 °C i 30 s, deretter 15 sykluser av denaturering på 98 °C i 7 s og avspenning/utvidelse ved 72 °C i 30 sekunder, etterfulgt av en siste utvidelse trinn ved 72 °C i 5 min., PCR-produktene ble renset med Zymo DNA Rent & Konsentrator-5-settet. Sammenkoblingen av HC og LC i forsamlingen produkter ble deretter analysert ved PCR med nestede primere spesifikke for de tre ulike HC og tre forskjellige LC (Ekstra fil 1: Figur S1e) ved hjelp av Phusion high-fidelity DNA-polymerase kit med følgende thermocycling betingelser: første denaturering på 98 °C i 30 sekunder, deretter 24 sykluser av denaturering på 98 °C i 7 s og avspenning/utvidelse ved 72 °C i 30 sekunder, etterfulgt av en siste utvidelse trinn ved 72 °C i 5 min., Nestede PCR-produkter ble lastet på en 1,2% TBE-agarosegel og atskilt med 90 V i 40 min. Real-time nestede PCR for kvantifisering av kryss-kontaminering ble gjennomført i triplicates med samme nestede primere ved hjelp av SYBRGreen master mix (Applied Biosystems) på en StepOne qPCR cycler (Applied Biosystems) med følgende thermocycling betingelser: første denaturering ved 95 °C i 10 min, etterfulgt av 40 sykluser av denaturering ved 95 °C i 15 s, annealing ved 56 °C i 30 sekunder og forlengelse ved 72 °C i 45 s., Den første abundances av forsterket montering produkter ble beregnet med 2^(-deltaCt) metode og plottet som bar diagrammer med feilmarginer som viser standardavvik fra gjennomsnittet.
Immunisering og CD19+ B-celle isolasjon fra perifere hele blodprøver
Den menneskelige perifer hele blodprøver som brukes i denne studien ble innhentet fra i.vent Diagnostica GmbH som biprodukter fra rutine diagnostiske prosedyrer. i.,vent Diagnostica GmbH har skriftlig informert samtykke fra donor til å bruke av-produkter for forskning og har en etisk godkjenning fra Freiburg Etikk Commission International (FEKI kode 011/1763) for distribusjon av prøver. En sunn proband gjennomgikk booster immunisering med Stivkrampe Toxoid (TT)/Diptheria Toxoid (DT) (Td-pur®; 20 Internasjonale enheter TT og 2 U DT; Novartis, Basel, Sveits)., K2-EDTA perifer hele blod stammer fra pre-immunisering (dag 0) og syv dager etter Td booster immunisering ble brukt til å isolere CD19+ B-celler ved hjelp av CD19 pluriBead Celle Separasjon Kit (pluriSelect GmbH, Leipzig, Tyskland) etter produsentens protokollen. Isolert CD19+ B-celle pellets ble vasket i 1 mL kaldt PBS og sentrifugerte på 300 g i 10 min ved 4 °C. Celle pellets tilsvarende 1,5 millioner B-celler fra både pre – og post-immunisering prøvene ble oppbevart på is inntil cycloheximide behandling og mikrosomer forberedelse.,
Emulsjon RT-PCR montering ved hjelp av menneskelige B-celle mikrosomer
Vi har lagt til 2 µL fortynnet mikrosomer forberedt fra frossen ARH-77-celler (som intern sammenkobling kontroll) 26 µL av resuspendert mikrosomer fra B-celler både pre – og post-Td immunisering, slik at den endelige brøkdel av ARH-77 mikrosomer er 0,5% (v/v). Vi utvannet 16 µL av dette mikrosomer suspensjon i 184 µL RT-PCR master mix inneholder 1× dART 1-trinn RT-PCR master buffer blanding (Roboklon), 2× dART master enzym blanding (Roboklon), 0.,5 µg/µL BSA, 100 µg/mL cycloheximide og primere for revers transkripsjon (IgM, IgG, og IgK) og tunge (VH) og lett kjede (VK) montering. Primer sekvenser og konsentrasjoner i RT-PCR master mix er oppført i annen fil 1: Tabell S2., Den resulterende 200 µL av vandig oppløsning ble brukt til å danne vann-i-olje emulsjon av dropwise tillegg (13 alikvoter av 15 µL i 30 s intervaller) til 800 µL olje fase består av 73% emulsjon komponent 1, 7% emulsjon komponent 2, og 20% emulsjon del 3 av Micellula DNA-emulsjon og rensing kit (Roboklon) under kontinuerlig røring på en magnetrører., Seks alikvoter av 100 µL hver av de resulterende emulsjon ble overført til PCR-rørene og utsatt for thermocycling med følgende betingelser: Revers transkripsjon ved 55 °C i 30 min, første denaturering ved 95 °C i 3 min, deretter tre sykluser av denaturering ved 95 °C for 20 s, annealing ved 56 °C i 30 sekunder og forlengelse ved 72 °C i 2 min, og deretter 20 sykluser av denaturering ved 95 °C for 20 s, annealing ved 56 °C i 30 sekunder og forlengelse ved 72 °C i 4 minutter, etterfulgt av en siste utvidelse trinn ved 72 °C i 5 min., PCR-montering produktene ble pakket ut fra emulsjonen ved hjelp av isobutanol (2-Metyl-1-propanol, Sigma) og Zymo DNA Rent & Konsentrator-5 kit (Zymo Forskning) som tidligere publisert . Den resulterende DNAs var lastet på en 1% TBE-agarosegel og atskilt med 100 V-for 45 min. Montering produkter av 700-800 bp var en størrelse som er valgt fra agarosegel, utvinnes ved hjelp av en Zymoclean Gel DNA-Recovery-kit, eluted i 6 mM Tris-Cl pH 8, og lagret ved − 20 °C til videre analyse.,
Nestede PCR-amplifikasjon av menneskelig B-celle montering produkter
For bestemte ytterligere forsterkning av HC-LC-montering produkter, en nestet PCR-amplifikasjon ble utført med nestede primere spesifikke for IgM, IgG, og IGK konstant områder (Ekstra fil 1: Tabell S2). PCR-reaksjonen som finnes nestede primere på 0,4 µM konsentrasjoner, 200 µM dNTP mix, 1× 5 reaksjon buffer og 0.02 U/µL 5 high-fidelity DNA-Polymerase (New England Biolabs) i en reaksjon volum på 50 µL med 3 µL av samlet DNA., Nestede PCR-amplifikasjon ble utført med følgende thermocycling betingelser: første denaturering på 98 °C i 3 min, deretter 34 sykluser av denaturering på 98 °C i 30 sekunder og avspenning/utvidelse på 71 °C i 1 min, etterfulgt av en siste utvidelse trinn ved 72 °C i 5 min. Prøvene ble samlet inn etter tre forskjellige PCR-syklus tall (28, 31 og 34 sykluser). Forsterket PCR-produkter ble lastet på 1% TBE-agarose gel og atskilt med 100 V i 60 min., Ønskede produkter av ~ 710 bp ble trukket ut som beskrevet ovenfor, sekvensering bibliotekene var forberedt på å følge Illumina TruSeq DNA-prøve forberedelse guide og 2 × 250 base sammenkoblede-end leser ble sekvensert ved hjelp av Illumina MiSeq plattform.
Bioinformatic analyse av sammenkoblede antistoff tung og lett kjede repertoires
Demultiplexing av 2 × 250 base sammenkoblede-end leser fra den MiSeq sekvensering plattformen ble utført basert på adapteren indekser og sekvensering data ble innhentet i fastq format., Leser bare med minimum Phred kvalitetspoeng av 10 over 50% av alle nukleotider ble beholdt og skannet for IgM -, IgG, og IgK konstant regionen sekvenser. Les par mangler konstant regionen sekvenser eller vise HC-HC eller LC-LC-strukturen ble filtrert ut og de resterende leser ble omgjort til fastq format, og brukes som input til analysen med MiXCR (v1.2) for justering av lyder til referanse V(D)J og C-gensekvenser fra IMGT database , utvinning og gruppering av CDR-H3 nukleotid (Ekstra fil 1: Tabell S1)., HC-CDR3 sekvenser som inneholder frameshifts eller stoppe codons og med mindre enn to som leser ble filtrert ut. Vi har opprettet en HC-LC sammenkobling statistikk-fil for å vise sammenkoblede VH-VK-genet bruk i den totale sammenkoblede HC-LC-genet repertoires. Varme kart ble generert ved hjelp av R og grafisk ved hjelp av ggplot2. Neste, inter-individuelle TT-spesifikke HC-CDR3 sekvenser ble identifisert ved å sammenligne HC-CDR3 aminosyre sekvenser hentet fra post-Td booster immunisering eksempel til tidligere rapportert TT-spesifikke HC-CDR3 sekvenser .,
PCR-amplifikasjon av full-lengde HC og LC-sekvenser
Vi har laget en to-trinns PCR-basert forsterkning metode (Ekstra fil 1: Figur S5) å innlemme begrensning fordøyelsen nettsteder for å potensielt TT-spesifikke HC og LC-med komplett V(D)J gen rekkefølge. Dette gjorde det mulig effektiv kloning av HC og LC-sekvenser i respektive uttrykk vektorer samt produksjon av rekombinante antistoffer for in vitro-bindende studier., Kort, vi valgte 14 sammenkoblede HC-LC CDR3 clonotypes innhentet fra IgG-sekvensering post-Td booster immunisering basert på deres frekvens, sammenkobling nøyaktighet, og brett forskjellen mellom top1 LC-CDR3 og top2 LC-CDR3 paret til den gitte HC-CDR3 rekkefølge. Vi hentet total RNA fra frossen B-celler isolert fra post-Td booster immunisering ved hjelp av TRIzol reagens (Ambion) rensing i henhold til produsentens instruksjoner. I det første trinnet, RT-PCR-amplifikasjon for hver valgte HC – og LC-CDR3 clonotype ble utført separat ved hjelp av dART-1-trinn RT-PCR kit (Roboklon)., RT-PCR master mix (25 µL) som finnes HC og LC V gene-spesifikke frem primere med BssHII begrensning nettstedet overheng sammen med individuelle CDR3-spesifikke revers primere med 18 nukleotider av FR4-regionen på 0,4 µM konsentrasjoner (Ekstra fil 1: Tabell S3 og Figur S5), 1× dART 1-trinn RT-PCR master buffer mix, 1× dART master enzym blanding, og 4,5 ng total RNA., Thermocycling forholdene var som følger: revers transkripsjon ved 55 °C i 30 min, første denaturering ved 95 °C i 3 min, så 23 sykluser av denaturering ved 95 °C for 20 s, annealing ved 56 °C i 30 sekunder og forlengelse ved 72 °C i 90 s, etterfulgt av en siste utvidelse trinn ved 72 °C i 5 min. RT-PCR-produktene ble renset ved hjelp av Agencourt AMPure XP – PCR-rensing kit (Beckman Coulter) følge produsentens instruksjoner og eluted i 6 mM Tris-Cl pH 8.0., I det andre trinnet, renset RT-PCR-produktene ble brukt som mal for PCR-amplifikasjon med 5 high-fidelity DNA-polymerase (New England Biolabs). Den nestede PCR master mix (50 µL) inneholdt frem primere koding en BssHII begrensning stedet og tre nukleotider av HC eller LC germline genet sekvens sammen med revers primere som inneholder komplett FR4-regionen og NheI/HindIII begrensning overheng på 0,4-mikrometer konsentrasjoner (Ekstra fil 1: Tabell S3 og Figur S5), 4 µL av renset DNA, 200 µM dNTP mix, 1× 5 reaksjon buffer, og 0.,02 U/µL 5 high-fidelity DNA-Polymerase (New England Biolabs). Thermocycling forholdene var som følger: første denaturering på 98 °C i 3 min, deretter 16 sykluser av denaturering på 98 °C i 30 s, avspenning 69 °C i 30 sekunder og forlengelse ved 72 °C i 1 min, etterfulgt av en siste utvidelse trinn ved 72 °C i 5 min. PCR-produktene ble separert på en TBE-agarosegel, full-lengde HC og LC amplikoner med restriksjon fordøyelsen steder ble hentet fra gel ved hjelp av det Zymoclean Gel DNA-Recovery-Kit (Zymo Forskning) og produkter ble lagret ved − 20 °C før videre bruk.,
Kloning og uttrykk av rekombinant monoklonale antistoffer
Begrensning fordøyelsen av full lengde HC og LC innlegg og uttrykk vektorer (pCMV-CD30-4IE3_HC og pCMV-CD30-4IE3_LC) ble utført med den begrensning enzymer BssHII, NheI og HindIII (New England Biolabs). Resultatet er produkter ble lastet på 2% TBE-agarose gel og band av ~ 5.9 kb for HC vektor ryggrad, 5.3 kb for LC-vektor ryggrad, ~ 370 bp for HC setter inn, og ~ 340 bp for LC setter inn ble size-valgt på agarose gel og renset som beskrevet ovenfor., Ligations av tilsvarende innlegg og vektorer for forsterket HC og LC clonotypes ble utført ved hjelp av instant sticky-end DNA ligase (New England Biolabs) og forvandlet til one-shot kjemisk kompetente E. coli TOP10-celler (IBA) følge instruksjonene fra produsenten. Plasmider DNAs var isolert fra forvandlet kolonier (8-16 kolonier) ved hjelp av QIAprep spinn miniprep kit (Qiagen); likheter til enighet sekvenser ble bekreftet ved hjelp av kapillær Sanger-sekvensering., HC og LC-plasmider DNA-sekvenser som passet nærmest konsensus sekvenser var co-transfekte i menneskets embryonalutvikling nyre cellelinje HEK 293 T (ATCC, CRL-11268) celler. HEK 293 T-cellene ble dyrket ved hjelp av rik glukose (4.5 g/L D-glukose) Dulbecco ‘s Modified Eagle’ s Medium (Gibco BRL) supplert med varme-inaktiverte ultra-lave IgG føtalt bovint serum (Thermo Fisher Scientific), 100 U/mL penicillin, og 100 µg/mL streptomycin. Renset plasmider DNAs for sammenkoblede HC og LC clonotypes var co-transfekte inn 85-95% confluent HEK 293 T-celler ved hjelp av PEI (polyethyleneamine, Polysciences)., Kultur supernatants var samlet fire dager etter transfection og TT antigen-spesifikke clonotypes ble identifisert ved indirekte ELISA.
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Vi har utført indirekte ELISA-analyser for å identifisere mAbs avledet fra vaksineres proband binding til TT-antigen ved hjelp av transfekte cellekultur supernatants. Nunc-Immuno Mikrotiterplateleser 96-brønns solide platene (Thermo Fisher Scientific) var belagt med 100 µL 10 µg/mL TT-antigen (Statens Serum Institut, København, Danmark) i 50 mM karbonat buffer pH 9.,6, inkubert over natten ved 4 °C, skylt tre ganger med PBS, og blokkert med 2% ikke-fett tørket melk (Bio-Rad) i PBS for 150 min ved romtemperatur. Etter å blokkere, 120 µL fra 1:2 serielt utvannet transfekte supernatants i PTM (PBS, 0.1% Tween-20, 2% ikke-fett tørket melk) ble lagt til brønnene, 350 ng av musen anti-TT mAb (GeneTex) ble brukt til en brønn som positiv kontroll, og platene ble inkubert for 1 time ved romtemperatur. Platene ble skylt tre ganger med PBS-T (0.,1% Tween-20), og 50 µL av en 1:2000 fortynning av geit anti-human kappa LC-HRP sekundært antistoff (Thermo Fisher Scientific) ble lagt til brønnene, 50 µL av en 1:2000 fortynning av geit anti-mus IgG HC-HRP sekundært antistoff (Sigma #A0168) ble lagt til den positive kontrollen vel, plater ble inkubert i 2 min ved romtemperatur og vasket tre ganger med PBS-T. For farge utvikling, vi har lagt til 50 µL av one-step Ultra TMB-ELISA-substrat (Thermo Fisher Scientific) per brønn, inkubert platene i 5 min ved romtemperatur, og stoppet Ag:Ab bindende reaksjon med tillegg av 50 µL 2 M H2SO4., Absorbansen ble målt ved 450 nm ved hjelp av GloMax Multi Detection System (Promega). ELISA-analyser for alle clonotypes ble utført i triplicates, verdiene var normalisert å fjerne bakgrunnen-signaler, og feil ble representert som standardavvik fra gjennomsnittet.
Analyse av chimeric amplikon formasjon under nestet PCR
Fire definert HC-LC amplikoner ble generert ved å forsterke HC og LC fra de respektive pCMV plasmider (se ovenfor), og ved hjelp av en PCR-montering reaksjon for å generere fire forskjellige HC-LC-samlinger., HC og LC-plasmider DNAs ble brukt som mal for PCR-amplifikasjon av Top1, Top2, Top3, og Top4 clonal kjede par ved å bruke primere som er spesifikke for de respektive VH og VK gen familier og IgG og IgK konstant områder (Ekstra fil 1: Tabell S2 og Figur S6a). Renset plasmider DNA (10 ng) ble lagt til i hver 25 µL PCR-reaksjonen som inneholder 0.4 µM av hver primer, 200 µM dNTP mix, 1× 5 reaksjon buffer, og 0,2 U/µL 5 high-fidelity DNA-Polymerase., Termisk sykling ble utført med første denaturering på 98 °C i 3 min, etterfulgt av 25 sykluser av denaturering på 98 °C i 30 s, avspenning/utvidelse på 71 °C i 1 min (for HC plasmider DNA) eller avspenning på 64 °C i 1 min og forlengelse ved 72 °C i 1 min (for LC-plasmider DNA), etterfulgt av en siste utvidelse trinn ved 72 °C i 5 min. PCR-produkter ble lastet på egen 1% TBE-agarose gel og atskilt med 100 V i 60 min. Ønsket DNA produkter av ~ 400 bp (for HC) og ~ 350 bp (for LC) var size-valgt og hentet fra gel som beskrevet ovenfor., Den rensede HC og LC-PCR-produktene ble brukt som mal for HC og LC-montering av overlapp extension PCR (Ekstra fil 1: Figur S6b). Kort, 5 ng av hver HC og tilsvarende sammenkoblede LC-DNA ble lagt inn i hver 50 µL PCR-reaksjonen som inneholder 1× dART 1-trinn RT-PCR master buffer (Roboklon), 2× dART master enzym (Roboklon), og 0,4 µM av hver IgG og IgK konstant regionen primer (Ekstra fil 1: Tabell S2)., Termisk sykling ble utført med RT inaktivering ved 95 °C i 3 min, etterfulgt av tre sykluser av denaturering ved 95 °C for 20 s, annealing ved 56 °C i 30 sekunder og forlengelse ved 72 °C i 2 min, etterfulgt av 25 sykluser av denaturering ved 95 °C for 20 s, annealing ved 56 °C i 30 sekunder og forlengelse ved 72 °C i 4 minutter, etterfulgt av en siste utvidelse trinn ved 72 °C i 5 min. Montering produkter ble lastet på 1% TBE-agarose gel og atskilt med 100 V-for 45 min. Montering produkter av ~ 750 bp var size-valgt og hentet fra agarosegel som beskrevet ovenfor., De individuelt montert HC-LC clonal parene ble samlet sammen og brukes som mal for nestede PCR-amplifikasjon med primere spesifikke for IgG og IgK konstant områder (Ekstra fil 1: Tabell S2, Figur S6c). Den nestede PCR-reaksjon og termisk sykling forholdene var de samme som beskrevet i «Nestede PCR-amplifikasjon av menneskelig B-celle montering produkter» – delen, bortsett fra at PCR-amplifikasjon ble utført for 25 sykluser. PCR-produkter ble lastet på 1% TBE-agarose-gel, atskilt med 100 V i 60 min og ønskede produkter av ~ 720 bp ble trukket ut som beskrevet ovenfor., Sekvensering biblioteker fra den enkelte samlinger og fra blandet sammenstillinger etter nestede PCR ble utarbeidet etter Illumina TruSeq DNA-prøve forberedelse guide og 2 × 250 base sammenkoblede-end leser ble generert ved hjelp av Illumina MiSeq plattform.