Hva er PCR? – Det Beginner ‘ s Guide

PCR er teknikken av moderne molekylærbiologiske laboratorier. Hvis du trenger å kopiere, rekkefølge eller kvantifisere DNA , du trenger å vite PCR. Kort sagt, PCR (polymerase chain reaction) er en biokjemisk teknikk som bruker thermocycling og enzymer for å raskt og pålitelig kopiere DNA, og den ble oppfunnet i et glimt av inspirasjon av en forsker kjøring på Motorvei 128 fra San Francisco til Mendocino.,

Denne artikkelen gir en kortfattet og enkel oversikt over PCR, med et par tips for å hjelpe deg å unngå de vanligste fallgruvene. Hvis du er ny, eller relativt nye PCR, så dette er for deg. (Og selv om du er erfaren på PCR-det er vel verdt å lese for å oppdatere, og kanskje ta et tips eller to!).

Grunnleggende PCR Ingredienser:

– Polymerase

Polymerases er enzymer som, under de rette forholdene, kan montere nye tråder av DNA fra mal DNA og nukleotider. Den opprinnelige PCR-reaksjonen var tungvint fordi de høye temperaturene som er nødvendig for å denaturering av DNA-ville drepe polymerases., Dette betydde at etter hver dusj syklus, nye polymerases som trengs for å bli lagt til manuelt reaksjonen– en kostbar bestrebelse. Men i moderne PCR-dette er ikke et problem, som polymerases som brukes i moderne PCR-vanligvis kommer fra en av to thermophilic bakterier kilder, Thermus aquaticus eller Pyrococcus furiosus. Disse polymerases, henholdsvis, Taq (uttales «tack») og Pfu (uttales «S-F-U») lett tåle høye temperaturer forbundet med en PCR-reaksjon., Kommersielle Taq-og Pfu polymerases er konstruert for hastighet, kvalitet, processivity (evne til å fullføre lange leser), og deres evne til å lese GC rik maler. Bedrifter er i stadig kommer ut med ny polymerases. Derfor, ikke betale for «hva er i fryseren», men shoppe rundt etter den beste kommersielle polymerase for PCR behov. Også snakke med din lokale salgsrepresentant, som de kan ofte gi ut gratis polymerase prøvene, slik at du kan bestemme hva som er best for deg.

Mal DNA

Dette er DNA som du har designet din primere til., Det er DNA som din polymerase vil lese og kopiere. Malen DNA kan være genom, plasmider eller cDNA, men uansett hva din kilde kvalitet teller. Jo mer intakt og renere malen DNA-jo lettere er det å få gode PCR-resultater. Husk også på den ideelle mengden av DNA vil avhenge av din kilde, vanligvis 1 pg – 1 ng av plasmider DNA eller 1 ng – 1 µg av genomisk DNA per PCR-reaksjonen.

Primere

Primere er korte fragmenter av syntetisk DNA som binder seg til malen DNA. Vil du trenger for å designe en «forward» primer og en «omvendt» primer., Din forward primer angir starten av PCR. Denne primeren er rekkefølgen er den samme som din 5-3 mal DNA-sekvens. Din revers primer betegner slutten av PCR. Denne primeren er sekvensen er det omvendt utfyller dine mal DNA. Generelt, primere er 18-22 base par lang. Men, viktigere enn lengden er smeltetemperaturen av primere. Smeltetemperaturen av primere bør være 54-60°C og så likt som mulig hver andre., Det er massevis av online kalkulatorer som kan beregne primer annealing temperaturer, og de fleste selskaper som syntetisere primere levere slike kalkulatorer.

Nukleotider

Som monomers av DNA, nukleotider er nødvendige for å gjøre DNA-kopier. For de fleste DNA pcr-er du vil bruke Deoxynucleoside triphosphates (dntp). Du kan kjøpe disse separat eller som en dGTP, dCTP, dATP og dTTP blanding. Uansett hva du kjøpe selv, husk at nukleotider er svært følsomme for fryse/tine sykluser. Derfor er det best å alltid lage små alikvoter av din dntp., Pass også på at du lagrer dem korrekt – bruk ikke frost-gratis fryser som går gjennom automatiske tine sykluser.

Buffer

de Fleste kommersielle polymerases kommer levert med deres ideelle buffer. Disse buffere ikke bare levere riktig pH, men de har alltid tilsetningsstoffer som magnesium, kalium, eller DMSO, som bidrar til å optimalisere DNA denaturing, renaturing, og polymerase aktivitet. Det vil være mer om disse tilsetningsstoffene i en kommende artikkel.

Thermocycling:

Dette er der magien skjer., Alle de ovennevnte ingrediensene er lagt til et PCR-rør og rør er thermocycled. For å oppnå thermocycling når PCR ble først oppfunnet individuelle PCR-rørene ble flyttet manuelt mellom oppvarmet vann bad. (Og du tror benken din jobb er kjedelig! Nå, takket være oppfinnelsen av «Mr. Sykluser», den første thermocycling maskin, temperatur-regulering er nå gjort automatisk av thermocyclers. Det følgende er en typisk PCR thermocycler profil:

Initialisering

I dette trinnet reaksjonen er oppvarmet til 94-96°C i 30 sekunder til flere minutter., Dette trinnet er vanligvis bare gjort én gang i begynnelsen av PCR-reaksjonen. Dette trinnet er viktig for aktivering av varme-start polymerases, hvis du bruker en slik polymerase, og til denaturering malen DNA. Husk at hvis malen GC-innhold er høyt du kan få behov for å utføre en ekstra lang initialisering trinn.

Denaturering (gjentatt 15-40 ganger)

I dette trinnet, reaksjonen er oppvarmet til 94-98°C i 15-30 sekunder. Dette trinnet denatures DNA og primere, som vil tillate dem å bindes spesifikt til hverandre i neste trinn.,

Avspenning (gjentatt 15-40 ganger)

I dette trinnet, reaksjon temperatur er raskt senket til 50-64°C i 20-40 sekunder. Temperaturen i dette trinnet må være lav nok til at din denaturert primere kan danne Watson-Crick base par med dine mal DNA. Men høy nok til at bare den mest stabile (perfekt sammen) dobbel-strandet DNA-strukturer kan danne. Vanligvis er dette perfekt avspenning temperaturen noen grader lavere enn smeltetemperaturen av primer par. Også under dette trinnet din polymerase vil binder seg til primer/mal DNA-komplekset., Selv om polymerase vil ikke begynne å lese før temperaturen er oppvokst i neste trinn.

Forlengelse eller Utvidelse (gjentatt 15-40 ganger)

I dette trinnet din reaksjon er raskt varmes opp til 72-80°C. Dette er når polymerase vil begynne å lese (i 5-3 retning) og kopiere malen DNA (i 3-5direction). Jo høyere temperatur under dette trinnet reduserer ikke-spesifikke primer/mal DNA vekselsvirkningene, og dermed øke spesifisiteten på din reaksjon., Men, den eksakte temperaturen vil bli bestemt av preferanse for din polymerase, så les deres emballasje. Lengden på dette trinnet avhenger av hvor lenge DNA-kopien. Vanligvis, DNA polymerase kan kopiere 1,000 base par per minutt. Derfor må du la det være minst 1 minutt extension gang per 1000 baser. På slutten av denne inkubasjon nye dobbel-strandet biter av DNA vil ha blitt opprettet, bestående av både mal og nye DNA.

Trinn 2-4 er så gjentatt 15-40 ganger

Det er sant at flere sykluser du programmet mer DNA-kopier du vil lage., Det er imidlertid en øvre grense. På enkelte punkt er tilgjengelig gratis nukleotider blir begrensende, og tidlig avkortet DNA-kopier kan bli et problem. Så ikke bli grådig med din sykling. Mindre, men godt, rent PCR-produktet som er å foretrekke for mange skitne produktet.

Siste tøyelighet

Dette er en ekstra, men ofte anbefalt trinn. I dette trinnet reaksjonen er holdt på 70-74°C i flere minutter. (Vanligvis vil du bruke den samme temperaturen som du brukte i Forlengelse eller Utvidelse trinn.) Dette trinnet lar polymerases til ferdig med å lese hva strand de er for tiden på., Dette er valgfritt trinn, kan bidra til å redusere antall avbrutte kopier i det endelige produktet.

Siste hold

Din reaksjon er nå fullført. Siden hele prosessen kan ta noen timer, PCR-reaksjoner er ofte gjort over natten, eller når du på annen måte har gått bort; det er anbefalt at du programmet thermocycler å holde din PCR-produktet ved 4°C til du kommer tilbake. Som du kan analysere eller bruker produktet, eller overføre det til et mer egnet langsiktig lagring som ditt kjøleskap.

lykke til og Happy PCR-ing!