Påvisning av Pneumocystis jiroveci i Luftveiene Prøver av Fire Farging Metoder

Pneumocystis jiroveci, tidligere kjent som Pneumocystis carinii, er fortsatt en viktig årsak til lungebetennelse hos immunsupprimerte pasienter, selv om infeksjoner med denne agenten har redusert etter den utbredte bruken av høyaktiv antiretroviral terapi (HAART) for humant immunsviktvirus (HIV) – infeksjon (9, 12). Pasienter som er immunsupprimerte for andre grunner enn HIV-infeksjon er også i fare for lungebetennelse forårsaket av P., jiroveci, inkludert pasienter med hematologisk malignitet og de som har mottatt immunsuppressive midler for behandling av autoimmune sykdommer (2, 11, 12).

Selv om en rekke nucleic acid amplification analyser, inkludert real-time PCR-analyser, har blitt utviklet for påvisning av P. jiroveci, disse analysene er ikke vanlig i de fleste kliniske laboratorier for mikrobiologi og er ikke tilgjengelig kommersielt (3, 5). Derfor, den fremste laboratorium metode for påvisning av P., jiroveci, en organisme som ikke kan bli dyrket av standard metoder, er den direkte visuell undersøkelse av kliniske prøver etter noen type flekker metode (12). Et utvalg av histochemical flekker har blitt brukt til å oppdage Pneumocystis i kliniske prøver. Disse histochemical flekker inkluderer Diff-Quik, Grocott-Gomori methenamine sølv (GMS), og Calcofluor white flekker. Diff-Quik flekken er en modifikasjon av Wright flekken (3). GMS flekken er en sølv nedbør flekken som vanligvis brukes til å visualisere sopp i histologic deler (10)., Calcofluor white flekken er et fluorescerende flekken, den aktive ingrediensen som er cellufluor, som nonspecifically binder seg til beta-knyttet polysakkarider, som chitin og cellulose, og brukes for direkte visualisering av sopp i kliniske prøver (4). Immunfluorescens flekker, som benytter seg av antistoffer rettet mot S. jiroveci, er også tilgjengelig for direkte påvisning av denne organismen i kliniske prøver (3, 5). Disse flekker er lik den direkte og indirekte immunfluorescens flekker brukes for påvisning av virus i kliniske prøver., Hver flekken har sine talsmenn; komparative data i HAART tid er begrenset.

Derfor, har vi utført en multi-institusjonell vurdering av fire brukte farging metoder for direkte påvisning av P. jiroveci i klinisk respiratoriske prøver. Lysbildene fra respiratoriske prøver studert, er de fleste som var bronchoalveolar lavage prøver, ble utarbeidet ved hjelp av cytocentrifugation. Replikere utstryk av 313 respiratoriske prøver innsendt for P. jiroveci undersøkelse ble undersøkt for tilstedeværelse av P. jiroveci med Calcofluor white (Fungifluor; Polysciences, Inc.,, Warington, Pa.), GSM, Diff-Quik (Baxter Vitenskapelige, McGraw Park, Ill.), og Merifluor Pneumocystis (Meridian Bioscience, Inc., Cincinnati, Ohio) flekker. Lysbilder ble farget med Merifluor Pneumocystis og Diff-Quik flekker i henhold til produsentens instruksjoner. For Calcofluor white farging, 1 dråpe Fungifluor ble lagt til hver side, dekkglasset ble brukt slik at reagens dekket hele prøven inneholder området, og skyv fikk lov til å sitte i minst 10 min i en mørk fuktkammeret ved romtemperatur før tolkning med et fluorescensmikroskop., For GMS farging, lysbilder var microwaved for 40 s i en 10% chromic sur løsning, vasket med vann, og deretter fjernet med 1% natrium metabisulfite for 30 s. Etter lysbildene ble vasket med destillert vann, de ble plassert i en skål Coplin inneholder for 50,0 ml methenamine fungerende løsning og microwaved for en annen 65 s., Lysbildene var skylles igjen med destillert vann, behandlet med 1% gull klorid for 2 til 5 s, skylles med destillert vann, er utsatt til 5% natrium thiosulfate for 1 minutter, counterstained med en lys grønn fungerende løsning, ryddet i xylen, dekket med dekkglass, og undersøkt av rutine lys-mikroskopi.

Hver av de laboratorier fra de fire deltakende institusjoner utført en av de ulike flekker og gjort sine tolkninger basert på at farging metode., Individer ved hver institusjon hadde erfaring med farging metode som utføres der, og tolkningen av flekken. Prøvene ble gitt en unik identifikasjonskode, og hver flekken ble undersøkt hver for seg, uten kunnskap om resultat oppnådd av en annen farging metode på den samme prøven., Mengden av prøven var sjelden nok til å gjøre alle de fire skliene; 308 lysbilder var tilgjengelig for farging med Calcofluor white, 310 lysbilder var tilgjengelig for farging med Merifluor Pneumocystis, 307 lysbilder var tilgjengelig for farging med Diff-Quik, og 310 lysbilder var tilgjengelig for farging med GMS. I ingen av tilfellene hvor en skyv var utilgjengelig på grunn av en utilstrekkelig mengde prøven gjorde kategoriseringen av at prøven som en sann positiv eller sanne negative (se nedenfor) avhenge av resultatet av den fraværende lysbilde.,

sensitivitet, spesifisitet, og positive og negative prediktive verdiene ble beregnet etter standard metoder (Tabell 1). Andelen av sant-positive og falske positive resultater for sammenkoblede testene ble sammenlignet med chi-kvadrat-test ved hjelp av EpiCalc 2000 statistisk programvare (www.brixtonhealth.com/epicalc.html).

Selv om de er mer sann-positive prøver ble oppdaget av den Merifluor Pneumocystis flekken, dette nummeret var ikke vesentlig forskjellig fra de som registreres av Calcofluor white (P = 0.260) og GRAM (P = 0.343) flekker., Tilsvarende har antall sanne positive oppdaget av GMS og Calcofluor white flekker var ikke signifikant forskjellig (P = 0.838) fra hverandre. Antall sanne positive oppdaget av Diff-Quik flekken, men var betydelig færre enn de som registreres av Merifluor Pneumocystis (P = 0.002), GRAM (P = 0.027), og Calcofluor white (P = 0.042) flekker. Antall falske positiver var ikke signifikant forskjellig mellom Calcofluor white, GMS, og Diff-Quik flekker (hver sammenligning hadde en P-verdi på >0.05)., Antall falske positiver rapportert etter farging med Merifluor Pneumocystis flekken, men var betydelig større enn de som er rapportert etter farging med GRAM (P = 0.004), Calcofluor white (P = 0.001), eller Diff-Quik (P = 0.001).

I noen tilfeller, en indusert sputum prøven kan bli den første prøven mottas for vurdering av tilstedeværelsen av Pneumocystis i den diagnostiske workup av en pasient med lungebetennelse som mistenkes å være forårsaket av denne organismen (6)., Hvis en indusert sputum prøven ikke klarer å gi etiologic agent av lungebetennelse, så vil en prøve fra bronchoalveolar lavage, som er betydelig mer kostbart og er bærer av en liten risiko for pasienten, kan være nødvendig for å oppnå diagnostisk materiale., På grunn av forskjeller i behandling av lungebetennelse forårsaket av Pneumocystis mot lungebetennelse forårsaket av andre mikroorganismer og mulige behov for bronkoskopi, noe som vil medføre ekstra kostnader og risiko for pasienten, i tilfelle at en diagnose ikke er etablert, er det viktig at den best mulig farging metoden brukes for påvisning av denne organismen.,

Videre, betydningen av en følsom og spesifikk farging metode i den æra av HAART er spesielt viktig, siden lavere forekomst av pneumoni forårsaket av Pneumocystis negativt påvirker den positive prediktive verdien av en analyse som har en spesifisitet mindre enn 100% (9). Selv om utbredelsen av lungebetennelse forårsaket av Pneumocystis er forskjellige i HAART era enn i pre-HAART-tiden, valg av optimal farging metode for påvisning av Pneumocystis er også viktig for pasienter med andre immunocompromising forhold som er i risiko for infeksjon., Faktisk, valg av optimal farging metoden kan være mer viktig for påvisning av Pneumocystis i ikke-HIV-smittet, immunsupprimerte pasienter, siden det har vist seg at respiratoriske prøver fra disse pasientene har en lavere belastning på organismer enn de fra HIV-smittet, immunsupprimerte pasienter (6).

I vår erfaring, Diff-Quik flekken var ikke et effektivt middel for screening for tilstedeværelse av P. jiroveci (dvs. en primær farging metode) på grunn av lav sensitivitet og negativ prediktiv verdi på denne flekken. Betydelig flere prøver som inneholdt S., jiroveci ble savnet av Diff-Quik metode enn med Calcofluor white, Merifluor Pneumocystis, og GMS. Raab et al. også beskrive både en lav sensitivitet (68%) og en lav spesifisitet (88%) når Diff-Quik flekken alene ble brukt for påvisning av Pneumocystis og annen sopp i bronchoalveolar lavage prøver (10). Disse funnene, men er i motsetning til de andre gruppene, som har rapportert at Diff-Quik-metoden var sammenlignbar med GRAM-farging metode for påvisning av Pneumocystis (7, 8)., Den ene gruppen rapporterte at Diff-Quik-metoden var mer sensitive enn Calcofluor white, direkte immunfluorescens flekker, og selv PCR, men disse resultatene har ikke blitt bekreftet (1).

Omvendt, Merifluor Pneumocystis flekken var den mest sensitive farging metoden, og kan vise seg nyttig som en skjerm for å utelukke tilstedeværelse av Pneumocystis, men det var det minste bestemt metode i denne studien. Imidlertid, antall falske positive resultater med Merifluor Pneumocystis flekken var betydelig større enn det som er rapportert for hver av de andre flekker., Den Merifluor Pneumocystis flekken hadde en positiv prediktiv verdi på bare 81.9%, sammenlignet med de tre andre metoder, som alle hadde positive prediktive verdier større enn 96%. Ng et al. har også beskrevet tilsynelatende falske positive resultater med denne farging metode (8). Derfor foreslår vi at hvis Merifluor Pneumocystis brukes som den primære farging metode i en klinisk mikrobiologisk laboratorium, så bekreftelse med en annen metode skal utføres for å øke spesifisitet og positiv prediktiv verdi på det endelige resultatet.,

følsomhet for både Calcofluor white og GMS flekker var mellomting mellom de av Diff-Quik og Merifluor Pneumocystis flekker, men de var svært spesifikke og hadde positive prediktive verdier over 96% og negative prediktive verdier over 93%. Fraire et al. har også beskrevet Calcofluor white og GMS flekker som sammenlignbare for påvisning av Pneumocystis, med 92.6% konkordans (4). Baughman et al., (1a) også beskriver følsomheten til en indirekte immunfluorescens-antistoff flekker som er rettet mot Pneumocystis og overlegen i følsomhet sammenlignet med en modifisert Wright flekken og en GMS flekken, men de rapporteres på en enkelt falskt positivt resultat og dermed en mye høyere spesifisitet enn vi beskriver. Det er mulig at med ytterligere praksis, kunne man lettere gjenkjenne pathognomonic former med Diff-Quik flekken, og dermed øke følsomheten av at analysen., På samme måte, kanskje med ytterligere erfaring med Merifluor Pneumocystis flekken, man kunne lære å bedre skille mellom sanne positive og falske positive farging og dermed redusere antall falske positive resultater.

I vår erfaring, Calcofluor white og GMS flekker har den beste parametere for rutinemessig bruk i et klinisk laboratorium. Selv om disse analysene var mindre sensitive enn immunfluorescens-analysen, var de svært spesifikke og hadde mer enn akseptabelt positive og negative prediktive verdier.,

• Copyright © 2004 American Society for Microbiology