«RNA-sekvensering er en høy gjennomstrømning neste generasjons sekvensering metode som brukes til å analysere genuttrykk og transcriptomics studier.»
Ribonucleic acid er en type nukleinsyre majorly involvert i genuttrykk, genet, regulering og koding/dekoding av informasjon.
mRNA – messenger-RNA er en kodende sekvens av et gen som er involvert i syntesen av protein, ca, 4% av RNA-potten består av mRNA mens resten er ikke-kodende RNAs.,
Om lag 90% av RNA er ikke-kodende, de er viktige for å utføre ulike funksjoner.
For eksempel,
- tRNA – overføringer aminosyre til ribosom-området, mens oversettelsen.
- rRNA – ribosom-RNA hjelper i oversettelse.
- microRNA – genuttrykk og regulering av genuttrykk.
- siRNA – beskytter en celle fra eksogene RNAs.
Et mRNA er en enkelt-strandet nukleinsyre transkribert fra et gen og protein som er oversatt.,
mRNA eller karakterutskrift inneholder kun den kodende sekvenser fra et gen. Dermed er det bare besitter sekvenser som er nødvendig i protein-formasjonen.
Nå, ved å analysere et mRNA, er det uttrykk for det aktuelle genet kan bestemmes.
Også, total RNA-undersøkelse gir oss en idé om hvilke gener som er knyttet til protein-formasjonen, og som ikke.
Betyr at mengden av total RNA, mRNA og ncRNA kan bestemmes ved å studere total RNA.,
Transcriptomics er studiet av hele mRNA – ofte kalt transcriptomes eller total RNA til stede i en celle eller mobil befolkning.
Ved å analysere transcriptome av en celle, hele pool av genuttrykk kan bli undersøkt. En av de viktigste teknikkene som brukes i transcriptomics studier er RNA-sekvensering.
transcriptome av en organisme er større, mer komplekse og mer usikker, i motsetning til den genom.
transcriptome varierer i ulike tilstand og et annet miljø., Livsstil, kosthold, trening, miljø, betingelser og andre eksterne faktorer spiller en betydelig rolle i transcriptome regulering.
Her i RNA-sekvensering, den cDNA syntetisert fra mRNA er sekvensert og kvantifisert i en sequencer. I denne artikkelen vil vi diskutere RNA-sekvensering bare men før det må du lese vår forrige artikkel om transcriptomics: Hva Er Transcriptomics?,
– Tasten Emner:
Prinsippet om RNA-sekvensering:
RNA-sekvensering er en neste generasjon, høy gjennomstrømning RNA-sekvensering og kvantifisering metoden som brukes for å studere transcriptomics og genuttrykk.
Et cDNA er konstruert fra total mRNA gjennom prosessen i revers transkripsjon og fragmentert. Samtidig, adapter ligation og bibliotek forberedelse er praktisert før du gjør sekvensering.
sequencer leser og tallfester cDNA komplementær til mRNA.,
Steps in RNA-seq:
- RNA isolation
- cDNA synthesis
- Adaptor ligation
- Library preparation
- DNA fragmentation
- Sequencing
- Downstream applications
RNA isolation:
The first step in the RNA sequencing is the isolation of total RNA, mRNA or ncRNA for the experiment.,
Isolere RNA er en langtekkelig prosess sammenlignet med DNA-isolering. RNA kan være sammenbrudd lett. Også sjansen for forurensning er høy i RNA-isolering.
Dermed ekstra forsiktighet må utvises mens isolere RNA og ekspert hånd i nødvendig for å gjøre det.
Høy kapasitet ren RNA-er må kreve for RNA-sekvensering.
renhet og mengde RNA er målt ved hjelp av Nanodrop eller qubit.
Note: for isolating mRNA from the total RNA pool, one additional step is required, using the oligo dT specific column in the purification or final step of elution, total mRNA can be isolated from the rest of RNAs.
Nå våre RNA eksempel er klar for neste trinn.,
Revers transkriptase PCR:
en Annen innovativ satt opp for RNA-sekvensering er å gjøre revers transkriptase PCR der RNA er omvendt transkribert i DNA.
ved Hjelp av en spesiell type polymerase kjent som DNA-revers transkriptase, den cDNA er syntetisert fra mRNA.
finn ut mer på RT-PCR her: Revers transkriptase-PCR.
Andre strand cDNA syntese:
Etter cDNA syntetisert fra mRNA, den andre strand DNA-syntese er må kreves. For at PCR utføres ved hjelp av de vanlige Taq DNA-polymerase i konvensjonell PCR.,
Polymerase legger dntp til den voksende DNA-tråden ved å bruke primer sett.
Bibliotek forberedelse:
Det første trinnet i biblioteket forberedelse eller NGS bibliotek forberedelse starter med fragmentations.
ved Hjelp av den spesielle type restriksjon endonucleases hele settet av ds cDNA er fragmentert for NGS.
Merk:
biblioteket forberedelse varierer fra plattform til plattform som noen fragmenter mRNA før du utfører revers transkriptase mens noen gjøre det senere, etter forberedelse av cDNA.,
I det siste trinnet av biblioteket forberedelse, endene er ligated med adapter sekvenser og forsterket for å reparere det ender. dA-tailing er valgfritt i tilfelle av mRNA-bibliotek.
Bibliotek rensing:
hele biblioteket er renset med klar til å bruke DNA-rensing kit.
I det siste trinnet, det er veldig viktig å rense hele fragment biblioteket for at konsentrasjonen av biblioteket er vurdert ved hjelp av kvantitativ PCR eller bioanalyzer.,
Merk:
For en nybegynner, tror jeg, bibliotek forberedelse og DNA-fragmentering er veldig vanskelig å forstå, så vi tror vi skal skrive en hel artikkel om Genomisk DNA fragmentering, bibliotek forberedelse og dens betydning i NGS.
Likevel, la oss gå videre,
I neste trinn, eksempel fragmenterte DNA er sendt for sekvensering.
DNA-sekvensering:
Nå prøven er sekvensert i høy gjennomstrømning NGS maskin som leser sekvensen så vel som tallfester nucleic acid så vel.,
kjemien bak sekvensering av cDNA er avhengig av hvilke plattformer vi bruker, selv om mye brukt metode er bruk av fluorescens kjemi.
I sequencer, enkelte fragmenter er «lese» separat og sekvensert. Den endelige data som er sendt til bioinformatikk lab for post-sekvensering analyse.,
Different types of RNA and its function:
| Abbreviation | RNA types | Function |
| mRNA | Messenger RNA | Codes for protein |
| tRNA | Transfer RNA | Transfer amino acid to the site of translation., |
| rRNA | Ribosomal RNA | Catalyse the translation reaction |
| miRNA | microRNA | Gene regulation |
| siRNA | Smaller interfering RNA | Gene regulation and maintaining gene expression. |
| LncRNA | Long non-coding RNA | Transcriptional regulation and epigenetic regulations., |
| snRNA | Small nuclear RNA | Helps in mRNA splicing and related functions |
| snoRNA | Small nucleolar RNA | Helps in RNA nucleotide modification |
| piRNA | Piwi-intercalating RNA | Function in defence against transposon; transposon defence system. |
| scaRNA | Small Cajal body-specific RNA | Also helps in nucleotide modifications (a type of snoRNA)., |
| shRNA | Små skarpe RNA | Syntetiske RNA-molekyl som hjelper i genet, regulering og kontroll av genuttrykk. |
Transcriptome data analyse:
En av de kjedelige jobber, som vi allerede har diskutert i forrige artikkel, er den transcriptome data analyse og tolkning av resultater. NGS data er store og mer komplekse.,
for å være Ærlig, undervisning data analyse av transcriptomics ikke er mulig, bør man ha for å ta hands-on trening for å lære, men jeg vil prøve å lære deg hva som er neste i denne prosessen.
Ulike fragmenter er sekvensert i maskinen og dataene er samlet inn. I neste trinn, basert på de flankerer region av fragmenter, den såkalte «contings» er arrangert for å få skjøte varianter.
I neste trinn, transcriptome er sammenlignet med referanse sekvens eller kan være samlet de novo.,
En kort oversikt over hele prosessen av RNA-seq.
Hele transcriptome sekvensering:
hele transcriptome av en celle eller et vev – alle RNAs (mRNA, tRNA, rRNA, sncRNA, microRNA og siRNA) er sekvensert og kvantifiseres. Med andre ord, kan vi si, Både romanen, så vel som kjente vitnemål, kan bli sekvensert.
For å gjøre det, hele settet av RNA er hentet fra vevsprøve.,
Målet RNA-sekvensering:
Et gen-spesifikke, klynge av gen-spesifikke, en vei-spesifikke eller sykdom relatert transcriptomes er sekvensert i mål-spesifikke RNA-sekvensering.
Målet RNA-sekvensering er mer rimelige og nøyaktige enn hele transcriptome sekvensering. Videre, mindre mengde RNA eksempel er nødvendig for å gjøre eksperimentet.
Små RNA-sekvensering:
En av de nye teknikken i RNA-sekvensering er å studere mindre ikke-kodende RNA i en celle fordi de er forbundet med så mange funksjoner i et genom.,
Små RNA-molekyler som miRNA, siRNA og piRNA kan kvantifiseres og sekvensert gjennom NGS basert RNA-sekvensering metode for ulike programmer.
mRNA-sekvenser:
Sekvens hele mRNA transkript ved hjelp av poly(A) – halen utvalget brukt for genuttrykk studier. Ved hjelp av mRNA-sekvenser kjent, samt romanen transkripsjonen endring kan påvises.
Fordeler av RNA-sekvensering:
En av de viktige fordelene av RNA-sekvensering er det ikke behov for før sekvensen informasjon., Så hele prosessen er ikke basert på probe-basert kjemi, før sekvensen informasjon for å utforme sonden er ikke nødvendig her.
Mer nøyaktige og følsomme genuttrykk studiet kan bli gjort.
Bredere dynamisk område.
Fange opp både kjente så vel som roman endringer av transkripsjonen, selv om ingen sekvens informasjon er tilgjengelig.
Selv om ingen referanse sekvens informasjon er tilgjengelig, RNA-sekvensering kan brukes for alle arter.
i Slekt: Syntetisk Genom – Metoder, Programmer Og Utfordringer.,
Konklusjon:
Endelig kan vi si, at RNA-seq metoden er mer avanserte og nøyaktige i forhold til microarray. Også, de novo mutasjoner kan også bli oppdaget ved hjelp av den.