16S rRNA gensequencing wordt gewoonlijk gebruikt voor de identificatie, classificatie en kwantificering van microben binnen complexe biologische mengsels zoals milieumonsters (ex zeewater) en darmmonsters (ex humaan darmmicrob)., Het gen 16S rRNA is een hoogst behouden component van de transcriptional machinerie van alle op DNA-gebaseerde levensvormen en zo is hoogst geschikt als doelgen voor het rangschikken van DNA in steekproeven die tot duizenden verschillende species bevatten. De universele PCR-inleidingen kunnen worden ontworpen om de behouden gebieden van 16S te richten die het mogelijk maken om het gen in een brede waaier van verschillende micro-organismen van één enkele steekproef te vergroten. Gemakshalve, bestaat het 16S rRNA gen uit zowel behouden als veranderlijke gebieden (Fig. 1)., Terwijl het behouden gebied universele versterking mogelijk maakt, staat het rangschikken van de veranderlijke gebieden discriminatie tussen specifieke verschillende micro-organismen zoals bacteriën, archaea en microbiële eukarya toe. De identificatie van virussen vereist metagenomische sequencing (de directe sequencing van het totale DNA dat uit een microbiële gemeenschap wordt geëxtraheerd) vanwege hun gebrek aan het fylogenetische markergen 16S.

Fig 1 – ongeveer 1,5 kb 16S rRNA-gen van E. coli dat de negen variabele gebieden aangeeft die het een ideaal doelwit maken als fylogenetisch markergen.,

oorspronkelijk was het voor onderzoek van milieumonsters nodig om soorten te kweken en te isoleren voor identificatie, een moeizaam en tijdrovend proces. Nochtans, heeft de koppeling van 16S rRNA PCR met het volgende-generatie rangschikken de studie van vele steekproeven bij lage kosten toegelaten. Vroege 16S rRNA die studies rangschikken hebben reeds vele opeenvolgingen gevonden die niet tot om het even welke bekende gecultiveerde species behoren, die erop wijzen dat er talrijke niet-geïsoleerde organismen zijn en dat de teelt gebaseerde methodes slechts een klein percentage van de bacteriële en archaeal species in een steekproef vinden., Bovendien, met het multiplexeren van vele steekproeven en de hoge die diepte van dekking door de platforms van next-gen van vandaag wordt geboden, kunnen wij nu steekproeven van uitvoerige tijdreeksen analyseren om microbiële gemeenschapsdynamiek over vele plaatsen te kwantificeren, of gedetailleerde 3D kaarten van microbiële gemeenschappen produceren, evenals onderzoeken of veranderingen in zeldzame of overvloedige species met gezondheid en ziekte worden geassocieerd.

Fig 2 – clustering van 5′ en 3′ leest uit verschillende milieumonsters laat zien dat monsters van een bepaald milieutype goed samengaan.,

Reads van de volgende generatie sequencing kunnen worden gestraald tegen gecureerde databases zoals het Ribosomal Database Project (RDP), GreenGenes en SILVA voor identificatie en classificatie. Verwante opeenvolgingen worden “geclusterd” en het aantal vertegenwoordigers van elke cluster geteld. Clusters van soortgelijke sequenties worden aangeduid als “operationele taxonomische eenheden” (OTUs). OTU tellingen worden samengevat in een tabel van relatieve abundanties voor elk organisme in elk monster., Tot op heden, zijn verscheidene analysepijpleidingen ontwikkeld voor analyse van 16S rRNA de gegevens van de genopeenvolging en twee algemeen gebruikte pijpleidingen zijn QIIME en Mothur. QIIME neemt gebruikers van hun ruwe sequencing output door middel van initiële analyses zoals OTU picking, taxonomische toewijzing, en de bouw van fylogenetische bomen uit representatieve sequenties van OTUs, en door downstream statistische analyse, visualisatie, en de productie van publicatie-kwaliteit graphics.,

LC Sciences biedt een uitgebreide 16srrna gen sequencing service voor identificatie en classificatie van species in microbiële monsters. We gebruiken een dual zone (amplified zones V3 + V4) 16S rDNA fragment amplification strategie, sequentie op het toonaangevende Illumina MiSeq platform en bieden uitgebreide data-analyse, waaronder: sequencing data output statistieken, sequentie clustering in operationele taxonomische eenheden (OTU), diversiteitsanalyse, soortenclassificatie en abundantie analyse.,onlangs heeft een van de klanten van LC Sciences 16S rRNA gensequencing gebruikt om microbiële voortplanting in de lucht te bestuderen in vervuilde gebieden waar ongunstige weersomstandigheden een dubbele verontreiniging van stof en smog veroorzaken.