GLP-1 en insulinesecretie
overzicht van de ATP-gevoelige route.
Glucose-gestimuleerde insulinesecretie (GSIS) wordt gereguleerd door een aantal Ionische en niet-ionische signaalwegen, ook bekend als de KATP-afhankelijke en-onafhankelijke routes (34,35). Het KATP-afhankelijke mechanisme van stimulus-secretie koppeling wordt besproken in Fig. 1., In het algemeen past de β-cel de insulinesecretie aan aan de heersende bloedglucosespiegels door middel van glucosemetabolisme. Wanneer glucoseniveaus stijgen, neemt de snelheid van glycolyse toe, die substraten (voornamelijk pyruvaat) voor mitochondriaal oxidatief metabolisme genereert, waarvan het resultaat de generatie van ATP is, of juister een verhoging van de ATP-to-ADP-verhouding (36). Deze gebeurtenis verschaft de functionele verbinding tussen een glucosestimulus en insulinesecretie., De verhoging van deze verhouding veroorzaakt de sluiting van β-cel KATP kanalen, leidend tot plasmamembraan depolarisatie, activering van voltage-afhankelijke Ca2+ kanalen (Vdcc ‘ s), en een verhoging van de intracellular concentratie van Ca2+ (i), de belangrijkste trigger voor insulinesecretie. Repolarisatie van β-cellen wordt waarschijnlijk bemiddeld door voltage-afhankelijke K+(Kv) kanalen en Ca2+-gevoelige voltage-afhankelijke K+(KCa) kanalen (37), die in reactie op glucose-veroorzaakte membraandepolarisatie openen om de uiterlijke flux van K + te herstellen., GLP-1 wordt voorgesteld om GSIS te moduleren door de activiteit van verschillende ionenkanalen die betrokken zijn bij KATP-afhankelijke insulinesecretie te reguleren, evenals stappen distaal naar kanaalmodulatie.
GLP – 1-en β-celkatp-kanalen.
een van de vele waargenomen cellulaire effecten van GLP-1 is de remming van β-cel KATP kanalen (38-40). De resulterende membraandepolarisatie die door KATP-kanaalsluiting wordt veroorzaakt initieert Ca2 + instroom door Vdcc ‘ s en veroorzaakt de exocytotische versie van insuline., Figuur 2 toont het prikkelende effect van GLP-1 op membraanpotentiaal en het remmende effect op zowel inheemse KATP-kanaalstromen van ins-1-cellen als stromen gemedieerd door recombinante KATP-kanalen (SUR1/Kir6.2) die samen met de GLP-1-receptor in een zoogdiercellijn worden uitgedrukt. De fysiologische gevolgen van GLP-1-gefaciliteerde KATP-kanaalsluiting zouden zijn: 1) vergroting van de prikkelbaarheid van cellen die reeds boven de drempel voor de afgifte van insuline liggen en 2) verhoging van het percentage β-cellen dat actief insuline afscheidt bij glucoseconcentraties die normaal onder de drempel voor de afgifte van insuline liggen.,
de consensus is dat het remmende effect van GLP-1 op KATP-kanalen cAMP/PKA-afhankelijk is (38-41), hoewel één studie met β-cellen bij ratten dit niet eens is (42). Deze bewering van Suga et al. (42) is gebaseerd op hun bevinding dat de specifieke PKA-remmer Rp-cAMPS (100 µmol/l) niet in staat was om de cellulaire depolarisatie en vermindering van de gehele cel KATP-stroom veroorzaakt door GLP-1 te voorkomen. De volledigheid van PKA-remming door Rp-cAMPS moet in twijfel worden getrokken omdat in dezelfde studie forskolin significante insulinesecretie induceerde, zelfs in aanwezigheid van Rp-cAMPS. Ten tweede, Suga et al., suggereert dat GLP-1 een lichte toename van de ATP gevoeligheid van het KATP kanaal veroorzaakt, zodat bij lage micromolaire ATP concentraties, het KATP kanaal vatbaarder zal zijn voor sluiting. In de normale β-cel in de pancreas van ratten zijn echter millimolaire ATP-niveaus aanwezig (43), en bij deze fysiologische ATP-niveaus worden zeer vergelijkbare KATP channel open probability (Po) in afwezigheid en aanwezigheid van GLP-1 als volgt voorspeld. Onze berekeningen geven aan dat met een intracellulair van 2 mmol/l, het KATP kanaal Po gereduceerd is van 0,005 naar 0,003 in aanwezigheid van GLP-1., Het is aannemelijk dat er in aanwezigheid van GLP-1 een verschuiving naar links van de ATP-gevoeligheid optreedt. Echter, de waargenomen grootte van GLP-1-geïnduceerde KATP stroom reductie gezien in hele-cel patch-clamp opnames (Fig. 2) is waarschijnlijk te groot om alleen te worden verklaard door de kleine dalingen in Po berekend op basis van de gegevens van Suga et al. (42). Recent onderzoek van ons laboratorium heeft aangetoond dat de membraanpermeante specifieke PKA-remmer H-89 (44) in staat is om de KATP-stroomvermindering door GLP-1 (45) volledig te remmen., Bovendien hebben anderen vergelijkbare resultaten laten zien met behulp van Rp-8-Br-cAMPS, een meer membraan-permeabel analoog van Rp-cAMPS (38,41). De werking van GLP-1 op KATP-kanalen kan ook andere signaalwegen omvatten, omdat aangetoond werd dat de remming van het KATP-kanaal door GLP-1 in de β-cellen van muizen calmoduline-afhankelijk is, gebruik makend van de calmodulineremmers W-7 en calmidazolium (46).
De glucoseafhankelijkheid van GLP-1-acties is goed vastgesteld, hoewel de precieze mechanismen voor deze afhankelijkheid onduidelijk zijn (41,47)., Nochtans, kunnen de cellulaire acties van PKA op het KATP-kanaal een verband tussen dit kinase en de glucosegevoeligheid van GLP-1 verstrekken. Andere groepen hebben aangetoond dat de toevoeging van de katalytische subeenheid van PKA (cPKA) aan uitgesneden flarden met KATP kanalen resulteert in een toename van KATP stroom (39,48). Ons laboratorium heeft onlangs aangetoond dat het effect van cPKA op KATP stroom afhankelijk is van ADP (45). Wanneer de ADP-spiegels verhoogd zijn, verhoogt cPKA de KATP-kanaalstroom in een recombinant systeem, in overeenstemming met de resultaten van Lin et al. (39)., Omgekeerd, als ADP niveaus worden verlaagd, cPKA vermindert KATP stroom (45). Fysiologisch kan dit resulteren in een verwaarloosbare verhoging van de β-cel exciteerbaarheid wanneer glucose niveaus laag zijn (hoog ), terwijl wanneer glucose niveaus stijgen (laag ), GLP-1-gemedieerde sluiting van KATP kanalen, via een pKa-afhankelijke route, leidt tot membraan depolarisatie en daaropvolgende verhogingen van β-cel exciteerbaarheid., Speciale aandacht moet worden besteed aan de cellulaire ATP-aan-ADP verhouding wanneer het overwegen KATP kanaal activiteit omdat het veranderingen in deze verhouding, meer dan eenvoudig veranderingen in intracellular per se, die de activiteit van KATP kanalen in de intacte β-cel regelen. Het vrije ATP wordt in hoge mate gebufferd binnen de cel door membraan en cytosolic Atpasen (43) en wordt voorspeld niet significant te veranderen met verhoogd glucosemetabolisme (36). De wederzijdse verandering in ADP, die niet in dezelfde mate wordt gebufferd, is daarentegen significanter en resulteert in een verandering in de ATP-tot-ADP-ratio (36)., Het belang van ADP bij de controle van de activiteit van het β-celkatp-kanaal is aangetoond, omdat mutaties in het ADP-sensorgebied van het menselijke KATP-kanaal leiden tot ongecontroleerde insulinesecretie en hypoglykemie (49). De moleculaire identiteit van de pKa phosphorylation site(s) is van significant belang en wordt nog onderzocht. Beide Kir6.,2 en SUR1 subeenheden van het KATP-kanaal bevatten veronderstelde doelsequenties voor PKA-gemedieerde fosforylering (39,48), en systematische mutatie van deze residuen zou de relatieve bijdragen van deze plaatsen aan de werking van PKA op het KATP-kanaal moeten verduidelijken.
GLP-1, Vdcc ‘ s en intracellulaire Ca2+ – opslag.
GLP-1 blijkt de stromen via Vdcc ‘ s in muizen, ratten en menselijke β-cellen te versterken (38,50–52), hoewel de omvang van dit effect varieert en vaak geen statistische significantie bereikt., In enkelvoudige humane β-cellen bleek GLP-1 de activiteit van het L-type VDCC en de amplitude van depolarisatie-geïnduceerde intracellulaire calciumtransiënten te verhogen, een effect dat 40% van de toename van GLP-1-potentieerde exocytose voor zijn rekening nam (52). Hoewel L-Type Vdcc ‘ s klassiek worden beschouwd als de belangrijkste regulatoren van Ca2+-instroom die leidt tot insulinesecretie, is het bekend dat β-cellen meerdere Ca2+ – kanaalisovormen tot expressie brengen (53). Pereverzev et al. (54) rapporteerde onlangs dat muizen zonder de A1E-isoform van Cav2.3 de glucosetolerantie en de insulinerespons op glucose hebben verminderd., Zij speculeren dat de G-eiwitregulatie van dit kanaal insulinesecretie kan moduleren op basis van de muscarine acetylcholine receptorregulatie van vdcc ‘ s in vitro (55).
we hebben in HIT-T15 insulinoomcellen die getransfecteerd zijn met de GLP-1 receptor ontdekt dat GLP-1 een toename van spanningsafhankelijke Ca2+ stromen veroorzaakt (zie 56 en Fig. 3A). Dit is ten minste gedeeltelijk te wijten aan een verschuiving naar links in de spanningsafhankelijkheid van activering die doet denken aan het effect van vdcc-fosforylering door PKA (57,58)., We hebben ook een verschuiving naar rechts waargenomen in de spanningsafhankelijkheid van steady-state inactivering, zodanig dat in aanwezigheid van GLP-1, minder kanalen effectief werden geïnactiveerd bij een gegeven houdingspotentiaal (50). Dit wordt ondersteund door Britsch et al. (50), die suggereren dat GLP-1 behandeling van muizen β-cellen de inactivering van spanningsafhankelijke Ca2+ stromen vertraagt. Bovendien leidde GLP-1 alleen tot een toename van intracellulair calcium na toevoeging van glucose, een effect dat gedeeltelijk werd geblokkeerd door VDCC-antagonisten (Fig. 3C)., Het vermogen van GLP-1 om Ca2 + stromen te verbeteren is, net als het effect op KATP kanalen, kamp afhankelijk (51,52), gebaseerd op het vermogen van Rp-kampen om een toename van de stromen te voorkomen. Inderdaad, behandeling van ratten β-cellen met dibutyryl cyclisch-AMP, een membraan-permeabel Camp analoog, repliceerde het effect van GLP – 1 op Ca2 + stromen (51)., Bovendien ging in onze studies (56) De vdcc-respons op GLP-1 verloren in HIT-T15-cellen die een mutante GLP-1-receptor tot expressie brachten zonder kritische residuen die nodig waren voor koppeling aan adenylylcyclase, terwijl de vdcc-activiteit nog kon worden versterkt door de cAMP independent agonist BAYK8644. Recent bewijs suggereert dat een A-kinase anchoring protein (AKAP), AKAP18, PKA richt op Vdcc ‘ s en dat dit kinase betrokken kan zijn bij GLP-1 modulatie van deze kanalen (59).,
naast effecten op Vdcc ‘ s kan GLP-1 intracellulaire calciumopslag mobiliseren op een cAMP-afhankelijke manier (60,61), mogelijk bijdragend aan de oscillatoire I-respons op GLP-1 die in HIT-T15-cellen wordt gezien (Fig. 3C) (62). Onze studies suggereren dat GLP – 1 toepassing resulteert in oscillaties in I in HIT-T15 cellen en dat deze oscillaties niet worden afgeschaft (hoewel ze zijn verminderd in amplitude) door verwijdering van extracellulaire Ca2+ of door vdcc blokkade (Fig. 3C)., In een aantal celtypen worden Ca2 + – oscillaties die door een agonist worden veroorzaakt, namelijk voornamelijk veroorzaakt door de afgifte van Ca2+ via inositoltrisfosfaat (IP3) en/of ryanodinegevoelige opslagplaatsen (63-65). In β-cellen mobiliseert GLP-1 Ca2 + – opslag grotendeels door de ryanodine receptor (waarschijnlijk het type 2 isovorm, RYR-2) te sensibiliseren voor het proces van Ca2+-geïnduceerde Ca2+ – afgifte (CICR) (61,66). Verscheidene studies hebben aangetoond dat GLP-1 i op PKA-onafhankelijke wijze kan verhogen (67-69)., Dit mechanisme is onlangs toegeschreven aan CICR uit ryanodine-gevoelige winkels via cAMP-gereguleerde guaninenucleotide exchange factor II (GEF-II of Epac2) en zijn interactie met of de Ras-Gerelateerde kleine G-eiwit Rap1 of met Rab3 kleine g-eiwit effector Rim2 (68). Het belang van cAMP-GEF-II-Rim2 is aangetoond, omdat inactivatie van dit complex (door antisense oligonucleotiden of mutantconstructies) de secretoire respons van muizeneilandjes of min6 insulinomacellen op GLP-1 (67) verminderde., Omdat de affiniteit van cAMP voor PKA veel hoger is (∼100 nmol/l) in vergelijking met cAMP-GEF-II (∼10 mmol/L), is het interessant om te speculeren dat de GLP-1-gestimuleerde cAMP-GEF-II route zou kunnen werken op een stijging van het lokale kamp in plaats van globale veranderingen., Hoewel de GLP-1 receptor signalering stimuleert IP3 productie in de GLP-1 receptor-het uiten van COS cellen (70), een rol voor IP3-gevoelige Ca2+ winkels in het global ik in twijfel, omdat de GLP-1-gestimuleerd IP3 productie in de primaire β-cellen is naar verluidt minimaal (71,72) en de IP3-receptor antagonist xestospongin C mislukt block release van de intracellulaire Ca2+ – winkels door forskolin behandeling (68). Echter, IP3-gereguleerde Ca2 + afgifte uit insuline granulaat is gesuggereerd door de studies van Nakagaki et al., (62), die suggereren dat GLP-1 op unieke wijze de tijdelijke en ruimtelijke afgifte van intracellulair calcium kan regelen door middel van lokale IP3-signalering. Dus, GLP-1-gemedieerde afgifte van intracellulaire opslag, samen met potentiëring van Ca2+ binnenkomst via Vdcc ‘ s, waarschijnlijk bijdragen aan het insulinotrope effect van GLP-1.
GLP – 1-en β-cel-KV-kanalen.
spanningsafhankelijke K+ – stromen, zoals die gemedieerd door KV-of KCa-kanalen, bemiddelen de repolarisatie van β-cellen na een depolariserende stimulus, zoals glucose (37)., Onlangs rapporteerden we dat de KV1-en Kv2-familiekanalen de insulinesecretie reguleren, omdat dominant-negatieve functionele knockout van een van deze kanaalfamilies GSIS verbeterde (73). Kv2. 1 kanalen bemiddelen het grootste deel van dit effect (>60%), waarvan het mechanisme gepaard gaat met verbeterde glucose-gestimuleerde membraandepolarisatie en Ca2+ entry (ongepubliceerde waarnemingen). Omdat β-cel KV stromen krachtige glucose-afhankelijke regulatoren van insuline secretie zijn, veronderstelden we dat fysiologische secretagogen, zoals GLP-1, kV kanaalfunctie kan regelen., We melden elders in dit supplement dat de GLP-1 receptor agonist exendin 4 spanningsafhankelijke uitgaande K+ stromen in rat β-cellen remt spanning-geklemd in de hele cel configuratie met 40% en aanzienlijk verlengt het tijdsverloop van β-cel repolarisatie na tijdelijke depolarisatie door huidige injectie. Dit in vergelijking met een vermindering van 86% van de uitwendige K+ – stromen die werd bereikt met de Algemene KV-kanaalantagonist tetraethylammonium. GLP-1 antagoniseerde spanningsafhankelijke uitgaande K + stromen in β-cellen van ratten in afwezigheid van glucose., Dit effect kan echter nog steeds bijdragen aan de glucoseafhankelijkheid van het insulinotrope effect van GLP-1, omdat normaal gesproken niet wordt verwacht dat KV-kanalen actief zijn tot na een glucose-geïnduceerde depolarisatie van het celmembraan (37). Bovendien, en vergelijkbaar met het effect van GLP-1 op de andere hierboven genoemde ionenkanalen, is exendin 4-gemedieerde remming van β-cel KV-kanalen afhankelijk van cAMP-signalering. Een recente studie suggereerde echter dat cAMP-signalering op zich niet voldoende was om spanningsafhankelijke K+-stromen in een insulineafscheidende cellijn tegen te werken (ins-1) (74).,
talrijke studies hebben effecten beschreven van hormoongemedieerde veranderingen in spanningsafhankelijke K+ stromen, zowel prikkelend als remmend. De best gekarakteriseerde van deze effecten is de spanningsafhankelijke K+ stroom downregulatie in lymfocyten en upregulatie in cardiale myocyten (75,76). In beide weefsels, is de cAMP / PKA signalerende weg betrokken bij de verordening van deze kanalen (76,77)., Rapporten suggereren dat cAMP spanningsafhankelijke K+ stromen in muriene lymfocyten (76) en een hypofyse cellijn (78) kan verminderen, maar spanningsafhankelijke K+ stromen in hart myocyten (77) kan verbeteren, een bevinding die is bevestigd op het enkelkanaalsniveau in kikkeratriale myocyten (79) en de reuzeninktvis axon (80)., Fosforylering kan direct op het kanaal optreden, omdat PKA-fosforylering van een atriaal KV-kanaal in de buurt van de NH2-terminus versterkte kanaalactiviteit (81) en fosforylering van KV1-kanaalalf-subeenheden de mate van remming van deze kanalen reguleert door een regulerende β-subeenheid (82). Fosforylering van β-subeenheden zelf kan ook de regulerende interactie met porievormende α-subeenheden moduleren (83). Onlangs is aangetoond dat regulering van een cardiaal KV-kanaal (KvLQT) door cAMP de expressie van AKAP15/18 of AKAP79 (84) vereist., Bovendien is een toename van de spanning-afhankelijke K+ stroom betrokken bij epinefrine-geïnduceerde remming van de glucose-afhankelijke toename van I in ob/ob en +/+ muis β-cellen (85) omdat het effect werd omgekeerd door tetraethylammonium. Interessant, werd het remmende effect van adrenaline op i ook omgekeerd door de adenylylcyclase activator forskolin (85). Daarom geloven we dat er steeds meer bewijs is om te suggereren dat hormonale modulatie van KV stromen fysiologisch belangrijk is. In het bijzonder zal GLP-1 remming van deze stromen naar verwachting leiden tot verhoogde β-cel exciteerbaarheid.,
GLP-1 en andere β – celionenkanalen.
Het is al lang bekend dat verhogingen in intracellulair kamp de na+ – stromen versterken (86), een effect dat gemedieerd kan worden door directe fosforylering door PKA (87). Een voorbijgaande Na+ huidige respons op cAMP werd voor het eerst beschreven in buikpotige neuronen en genoemd INa(cAMP) (88)., In insuline-afscheidende cellen, is de expressie van RNA van de niet-selectieve kationen mstrpc4 en LTRPC2 onlangs ontdekt in respectievelijk insulinomacellen en menselijke eilandjes (89), en cAMP is gemeld om de genexpressie van mnsc1 te veroorzaken, die een muis niet-specifiek kationkanaal codeert (NSCC) (90). GLP-1 wordt verondersteld een NSCC te versterken die voornamelijk Na+ stromen draagt (91,92). Dit effect treedt op door GLP-1 ‘ s activering van cAMP-signalering en afgifte van intracellulaire Ca2+ – opslag en kan dienen als nog een andere belangrijke modulatoire route voor GLP-1 in de β-cel (40)., Het is niet duidelijk of de NSCC ‘ s die door GLP-1 worden geactiveerd, overeenkomen met de niet-selectieve kationenstroom die wordt geproduceerd door activering van de Ca2+ – receptor (93), maar naar verluidt impliceert dit laatste effect geen activering van de Gs-subeenheid en kan het daarom niet het cAMP/PKA-traject betreffen.
Er is weinig bekend over de effecten van GLP-1 op andere ionenkanalen. Celzwelling-geactiveerde CL-stromen zijn gedetecteerd in insuline-afscheidende cellen (94), maar een rol voor deze kanalen in insuline secretie is onduidelijk., Cl-kanalen zoals cystic fibrosis transmembrane conductance regulator en uiterlijk rectificerende Cl− kanalen worden geactiveerd door cAMP / PKA signalering (95). Als het voorkomen in de β-cel, zou dit effect neigen om depolarisatie te bevorderen. Een rapport suggereert dat GLP-1 een Ca2+− gevoelige CL-stroom activeert in Xenopus oöcyten die de GLP-1 receptor tot expressie brengen (96), een effect dat afhankelijk was van ins(1,4,5) P3-afhankelijke intracellulaire Ca2+ mobilisatie (96). Het blijft echter nog te bepalen of GLP-1 Cl− stromen in insuline-afscheidende cellen kan stimuleren.
GLP-1 en exocytose.,
Glucose kan een stimulerend effect hebben op insuline-exocytose, onafhankelijk van de goed gekarakteriseerde werking die wordt geïnitieerd door de remming van KATP-kanalen. Het belang van deze weg kan gedeeltelijk door het feit worden gerealiseerd dat muizen met een gerichte verstoring in KATP (kir 6.2 of SUR1) geen openlijke abnormaliteiten in glucosetolerantie vertonen (97,98). De KATP-onafhankelijke insulinesecretie wordt niet goed begrepen en verondersteld om verscheidene signalen te impliceren die op nietionic doelstellingen handelen, in het bijzonder de distale stappen van exocytose., Men heeft voorgesteld dat glucosemetabolisme voor dit stimulerend effect wordt vereist en dat de waarschijnlijke signalen ATP, cAMP, glutamaat, en malonyl-CoA (rev.in 99 en 100) omvatten. Gezien het feit dat ATP, cAMP en PKA allemaal betrokken zijn bij het exocytotische proces, is het aannemelijk om te denken dat GLP-1 effecten kan hebben die distaal zijn voor acties op ionenkanalen, waardoor de insulinesecretie verder toeneemt. Het is algemeen bekend dat acties die de GLP-1-geïnduceerde cAMP-accumulatie en PKA-activering onderdrukken, de insulinesecretie remmen, wat suggereert dat cAMP en/of PKA de plausibele effecten zijn (101)., In muizen β-cellen kan slechts een fractie van exocytose worden verklaard door acties op stimulus-secretie koppeling (102). Uit studies die aantonen dat cAMP secretie induceert in aanwezigheid van lage en hoge i, wordt gesuggereerd dat cAMP de exocytotische machines sensibiliseert. Studies die photoreleasable cAMP en PKA-inhibitors gebruiken tonen aan dat cAMP PKA-afhankelijke en-onafhankelijke gevolgen op exocytose oproept. De verhogingen van cAMP, onafhankelijk van PKA-activering, lijken exocytose van de gemakkelijk vrij te geven pool in β-cellen te versnellen (103)., PKA-afhankelijke mobilisatie van secretoire korrels, in tegenstelling tot de generatie van cAMP zelf, lijkt glucosemetabolisme (verhoogde ATP/ADP) te vereisen en impliceert de translocatie van korrels (103.104). Een dergelijk effect zou de grootte van de gemakkelijk vrij te geven pool verhogen, de snelheid van aanvulling van de pool verhogen, en exocytose verbeteren. Omdat GLP-1 zowel cAMP als PKA kan verhogen, kunnen uit deze gegevens effecten op exocytose worden geïmpliceerd., Er zijn verschillende potentiële doeleiwitten voor de werking van GLP-1, waaronder β-celoplosbare n-ethylmaleimide-gevoelige factor attachment protein receptor (SNARE) eiwitten (105).