Detection of Pneumocystis jiroveci in Respiratory Specimens by Four kleuring Methods

Pneumocystis jiroveci, voorheen bekend als Pneumocystis carinii, blijft een belangrijke oorzaak van pneumonie bij immuungecompromitteerde patiënten, hoewel infecties met dit middel zijn afgenomen na het wijdverbreide gebruik van highly active antiretrovirale therapie (HAART) voor infectie met het humaan immunodeficiëntievirus (HIV) (9, 12). Patiënten die immunogecompromitteerd zijn om andere redenen dan HIV-infectie lopen ook het risico op longontsteking veroorzaakt door P., jiroveci, met inbegrip van patiënten met hematologische maligniteiten en patiënten die immunosuppressiva hebben gekregen voor de behandeling van auto-immuunziekten (2, 11, 12).

hoewel verschillende nucleic acid amplification assays, waaronder real-time PCR assays, zijn ontwikkeld voor de detectie van P. jiroveci, zijn deze assays niet gebruikelijk in de meeste klinische microbiologische laboratoria en zijn ze niet commercieel beschikbaar (3, 5). Daarom is de belangrijkste laboratoriummethode voor de detectie van P., jiroveci, een organisme dat niet volgens standaardmethoden kan worden gekweekt, is het directe visuele onderzoek van het klinische monster na een bepaalde kleuringsmethode (12). Een verscheidenheid van histochemische vlekken is gebruikt om Pneumocystis in klinische specimens te ontdekken. Deze histochemische vlekken omvatten de diff-Quik, Grocott-Gomori methenamine zilver (GMS), en Calcofluor witte vlekken. Diff-Quik stain is een modificatie van Wright stain (3). GMS-vlek is een zilveren precipitatievlek die algemeen wordt gebruikt om schimmels in histologische secties (10) te visualiseren., De witte vlek van Calcofluor is een fluorescente vlek, waarvan het actieve ingrediënt cellufluor is, die niet specifiek aan bèta-gekoppelde polysachariden, zoals chitine en cellulose bindt, en voor de directe visualisatie van schimmels in klinische specimens (4) wordt gebruikt. Immunofluorescente vlekken, die antilichamen tegen P. jiroveci gebruiken, zijn ook beschikbaar voor de directe opsporing van dit organisme in klinische specimens (3, 5). Deze vlekken zijn gelijkaardig aan de directe en indirecte immunofluorescent vlekken die voor de opsporing van virussen in klinische specimens worden gebruikt., Elke vlek heeft zijn voorstanders; vergelijkende gegevens in het HAART-tijdperk zijn beperkt.

daarom hebben we een multi-institutionele beoordeling uitgevoerd van vier veelgebruikte kleuringsmethoden voor de directe detectie van P. jiroveci in klinische respiratoire specimens. De dia ‘ s van de bestudeerde respiratoire specimens, waarvan de meerderheid bronchoalveolaire lavage specimens waren, werden bereid met behulp van cytocentrifugatie. Replicate uitstrijkjes van 313 respiratoire specimens ingediend voor P. jiroveci onderzoek werden onderzocht op de aanwezigheid van P. jiroveci met de calcofluor Wit (Fungifluor; Polysciences, Inc., Warington, Pa.), GMS, Diff-Quik (Baxter Scientific, McGraw Park, Ill.), en Merifluor Pneumocystis (Meridian Bioscience, Inc., Cincinnati, Ohio) vlekken. De objectglaasjes werden volgens de instructies van de fabrikant bevlekt met de Merifluor Pneumocystis-en Diff-Quik-vlekken. Voor het Witte bevlekken van Calcofluor, werd 1 daling van Fungifluor aan elke dia toegevoegd, werd de coverslip toegepast zodat het reagens het volledige specimen-bevattende gebied bedekte, en de dia werd toegestaan om minstens 10 min in een donkere Vochtigheidskamer bij kamertemperatuur vóór interpretatie met een fluorescentiemicroscoop te zitten., Voor GMS-kleuring werden de objectglaasjes 40 s in de magnetron in een 10% chroomzuuroplossing, gewassen met water en vervolgens 30 s gezuiverd met 1% natriummetabisulfiet. nadat de objectglaasjes met gedestilleerd water waren gewassen, werden ze in een Coplin-pot met 50,0 ml methenamine-werkoplossing geplaatst en nog eens 65 s in de magnetron., De glaasjes werden opnieuw gespoeld met gedestilleerd water, behandeld met 1% goudchloride gedurende 2 tot 5 s, gespoeld met gedestilleerd water, blootgesteld aan 5% natriumthiosulfaat gedurende 1 min, tegenbehandeld met een lichtgroene werkoplossing, geklaard in xyleen, bedekt met deksel slips, en onderzocht door middel van routine lichtmicroscopie.

elk van de laboratoria van de vier deelnemende instellingen voerde een van de verschillende vlekken uit en gaf hun interpretaties op basis van die kleuringmethode., De individuen in elke instelling hadden ervaring met de kleuring methode die daar werd uitgevoerd en de interpretatie van de vlek. De specimens kregen unieke identificatiecodes en elke vlek werd onafhankelijk onderzocht, zonder kennis van het resultaat dat met een andere kleuringsmethode op hetzelfde specimen werd verkregen., De hoeveelheid monsters was zelden onvoldoende om alle vier de objectglaasjes te maken; 308 objectglaasjes waren beschikbaar voor kleuring met Calcofluor white, 310 objectglaasjes waren beschikbaar voor kleuring met Merifluor Pneumocystis, 307 objectglaasjes waren beschikbaar voor kleuring met Diff-Quik en 310 objectglaasjes waren beschikbaar voor kleuring met GMS. In geen van de gevallen waarin een dia niet beschikbaar was vanwege een onvoldoende hoeveelheid specimen was de categorisering van dat specimen als een waar positief of waar negatief (zie hieronder) afhankelijk van het resultaat van de afwezige dia.,

de gevoeligheid, specificiteit en positieve en negatieve voorspellende waarden werden berekend met behulp van standaardmethoden (Tabel 1). De percentages waar-positieve en fout-positieve resultaten voor gepaarde tests werden vergeleken met de chi-kwadraattest met behulp van de statistische software EpiCalc 2000 (www.brixtonhealth.com/epicalc.html

hoewel door de Merifluor Pneumocystis-kleuring meer true-positive monsters werden gedetecteerd, verschilde dit aantal niet significant van het aantal monsters dat door de calcofluor white (p = 0,260) en GMS (p = 0,343) – kleuring werd gedetecteerd., Op dezelfde manier was het aantal echte positieven ontdekt door GMS en Calcofluor witte vlekken niet significant verschillend (p = 0,838) van elkaar. Het aantal true positieven dat door diff-Quik-kleuring werd gedetecteerd, was echter significant lager dan het aantal dat door de Merifluor Pneumocystis (P = 0,002), GMS (P = 0,027) en Calcofluor white (P = 0,042) – kleuring werd gedetecteerd. Het aantal false positieven was niet significant verschillend tussen de witte vlekken van Calcofluor, GMS en Diff-Quik (elke vergelijking had een p-waarde van >0,05)., Het aantal valse positieven dat werd gemeld na kleuring met merifluor Pneumocystis-kleuring was echter significant groter dan het aantal dat werd gemeld na kleuring met GMS (P = 0,004), Calcofluor Wit (P = 0,001) of Diff-Quik (P = 0,001).

in sommige gevallen kan een geïnduceerd sputummonster het eerste monster zijn dat wordt ontvangen voor de beoordeling van de aanwezigheid van Pneumocystis in het diagnostische onderzoek van een patiënt met pneumonie waarvan wordt vermoed dat deze door dit organisme wordt veroorzaakt (6)., Als een geïnduceerd sputum specimen er niet in slaagt om de etiologische agent van longontsteking op te leveren, dan kan een specimen van bronchoalveolaire lavage, die beduidend duurder is en een klein risico voor de patiënt draagt, nodig zijn om diagnostisch materiaal te verkrijgen., Vanwege de verschillen in de behandeling van pneumonie veroorzaakt door Pneumocystis versus pneumonie veroorzaakt door andere micro-organismen en de mogelijke behoefte aan bronchoscopie, die extra kosten en risico voor de patiënt met zich meebrengt, in het geval dat een diagnose niet wordt vastgesteld, is het belangrijk dat de best mogelijke kleuring methode worden gebruikt voor de detectie van dit organisme.,

bovendien is het belang van een gevoelige en Specifieke kleuringsmethode in het HAART-Tijdperk bijzonder belangrijk, aangezien de lagere prevalentie van pneumonie veroorzaakt door Pneumocystis een negatief effect heeft op de positieve voorspellende waarde van elke test met een specificiteit van minder dan 100% (9). Hoewel de prevalentie van pneumonie veroorzaakt door Pneumocystis in het HAART-Tijdperk anders is dan in het pre-HAART-tijdperk, is de keuze van de optimale kleuringsmethode voor de detectie van Pneumocystis ook belangrijk voor patiënten met andere immunocompromisaandoeningen die risico lopen op infectie., In feite kan de keuze van de optimale kleuringsmethode belangrijker zijn voor de detectie van Pneumocystis bij niet-HIV-geïnfecteerde, immuungecompromitteerde patiënten, omdat is aangetoond dat respiratoire monsters van deze patiënten een lagere belasting van organismen hebben dan die van HIV-geïnfecteerde, immuungecompromitteerde patiënten (6).

in onze ervaring was de diff-Quik-vlek geen effectief middel om de aanwezigheid van P. jiroveci (d.w.z. een primaire kleuringsmethode) te onderzoeken vanwege de lage gevoeligheid en negatieve voorspellende waarde van deze vlek. Aanzienlijk meer exemplaren die P. bevatten, jiroveci werd gemist door de Diff-Quik-methode dan met Calcofluor white, Merifluor Pneumocystis en GMS. Raab et al. beschrijf ook zowel een lage gevoeligheid (68%) als een lage specificiteit (88%) wanneer alleen de diff-Quik-vlek werd gebruikt voor de detectie van Pneumocystis en andere schimmels in bronchoalveolaire spoelmonsters (10). Deze bevindingen zijn echter in tegenstelling tot die van andere groepen, die hebben gemeld dat de Diff-Quik-methode vergelijkbaar was met de GMS-kleuringsmethode voor de detectie van Pneumocystis (7, 8)., Eén groep meldde dat de Diff-Quik methode gevoeliger was dan Calcofluor white, directe immunofluorescente kleuring, en zelfs PCR, maar deze resultaten zijn niet bevestigd (1).

omgekeerd was de Merifluor Pneumocystis vlek de meest gevoelige kleuring methode en kan nuttig zijn als een scherm om de aanwezigheid van Pneumocystis uit te sluiten, maar het was de minst specifieke methode in deze studie. Het aantal fout-positieve resultaten met de Merifluor Pneumocystis-vlek was echter aanzienlijk groter dan voor elk van de andere vlekken werd gerapporteerd., De merifluor Pneumocystis-vlek had een positieve voorspellende waarde van slechts 81,9%, vergeleken met de andere drie methoden, die alle positieve voorspellende waarden van meer dan 96% hadden. Ng et al. met deze kleuringmethode ook schijnbare vals-positieve resultaten hebben beschreven (8). Daarom stellen we voor dat als Merifluor Pneumocystis wordt gebruikt als de primaire kleuringsmethode in een klinisch microbiologisch laboratorium, dan bevestiging met een tweede methode moet worden uitgevoerd om de specificiteit en positieve voorspellende waarde van het uiteindelijke testresultaat te verhogen.,de gevoeligheden van zowel de Calcofluor white-als de GMS-vlekken lagen tussen die van de diff-Quik-en de Merifluor Pneumocystis-vlekken, maar ze waren zeer specifiek en hadden positieve voorspellende waarden boven 96% en negatieve voorspellende waarden boven 93%. Fraire et al. hebben ook de calcofluor witte en GMS vlekken als vergelijkbaar voor de detectie van Pneumocystis beschreven, met 92,6% concordantie (4). Baughman et al., (1a) beschrijf ook de gevoeligheid van een indirecte immunofluorescente antilichaamvlek die naar Pneumocystis is gericht en superieur in gevoeligheid vergeleken met een gewijzigde Wright-vlek en een GMS-vlek, maar zij rapporteerden op één enkel vals-positief resultaat en daarom een veel hogere specificiteit dan wij beschrijven. Het is mogelijk dat met extra oefening, men gemakkelijker de pathognomonische vormen met de diff-Quik vlek zou kunnen herkennen, waardoor de gevoeligheid van die test wordt verhoogd., Op dezelfde manier zou men, misschien met extra ervaring met de merifluor Pneumocystis vlek, kunnen leren om beter onderscheid te maken tussen true-positive En false-positive kleuring en daardoor het aantal false-positive resultaten te verminderen.

in onze ervaring hebben de witte vlekken Calcofluor en GMS de beste parameters voor routinematig gebruik in een klinisch laboratorium. Hoewel deze tests minder gevoelig waren dan de immunofluorescentietest, waren ze zeer specifiek en hadden ze meer dan aanvaardbare positieve en negatieve voorspellende waarden.,

• Copyright © 2004 American Society for Microbiology