“RNA-sequencing is een” high throughput next-generation sequencing ” – methode die wordt gebruikt om genexpressie en transcriptomicastudies te analyseren.”
ribonucleïnezuur is een type nucleïnezuur dat voornamelijk betrokken is bij de genexpressie, genregulatie en codering/decodering van informatie.
mRNA-messenger-RNA is een coderende sequentie van een gen betrokken bij de synthese van eiwitten, ongeveer 4% van de RNA-pool bestaat uit mRNA, terwijl rest niet-coderende RNAs zijn.,
hoewel ongeveer 90% van RNA niet-codeert, zijn deze belangrijk voor het uitvoeren van verschillende functies.
bijvoorbeeld,
- tRNA-transfers het aminozuur naar de ribosomale site, terwijl de vertaling.
- rRNA-ribosomaal RNA helpt bij de vertaling.
- microRNA-genexpressie en regulatie van genexpressie.
- siRNA-beschermt een cel tegen de exogene RNAs.
een mRNA is een enkelstrengs nucleïnezuur dat wordt getranscribeerd uit een gen en waaruit het eiwit wordt vertaald.,
het mRNA of transcript bevat alleen de codeersequenties van een gen. Aldus bezit het slechts de opeenvolgingen die in de eiwitvorming worden vereist.
door het analyseren van een mRNA kan voortaan het expressiepatroon van het verwante gen worden bepaald.
ook geeft totaal RNA-onderzoek ons een idee over welke genen verbonden zijn met de eiwitvorming en welke niet.
betekent dat de hoeveelheid totaal RNA, mRNA en ncRNA kan worden bepaald door het totale RNA te bestuderen.,
Transcriptomica is de studie van het gehele mRNA – vaak genoemd als transcriptomen of totaal RNA aanwezig in een cel of celpopulatie.
door het transcriptoom van een cel te analyseren, kan de volledige pool van de genexpressie worden onderzocht. Een van de belangrijke technieken die in transcriptomicastudies worden gebruikt is het rangschikken van RNA.
het transcriptoom van een organisme is groter, complex en onzekerder, in tegenstelling tot het genoom.
het transcriptoom varieert in verschillende toestand en in een andere omgeving., Levensstijl, dieet, oefening, milieu, voorwaarden en andere externe factoren spelen een belangrijke rol in transcriptome regelgeving.
hier in de RNA-sequencing wordt de uit het mRNA gesynthetiseerde cDNA gesequenced en gekwantificeerd in een sequencer. In dit artikel zullen we alleen de RNA-sequencing bespreken, maar daarvoor lezen we ons vorige artikel over transcriptomica: Wat is Transcriptomica?,
belangrijke onderwerpen:
principe van RNA-sequencing:
RNA-sequencing is een volgende generatie, hoge doorvoer RNA-sequencing en kwantificeringsmethode die wordt gebruikt voor het bestuderen van de transcriptomica en genexpressie.
een cDNA wordt opgebouwd uit totaal mRNA door het proces van omgekeerde transcriptie en gefragmenteerd. Gelijktijdig, adapter ligation en bibliotheekvoorbereiding worden beoefend alvorens het rangschikken te doen.
de sequencer leest en kwantificeert de cDNA als aanvulling op de mRNA.,
Steps in RNA-seq:
- RNA isolation
- cDNA synthesis
- Adaptor ligation
- Library preparation
- DNA fragmentation
- Sequencing
- Downstream applications
RNA isolation:
The first step in the RNA sequencing is the isolation of total RNA, mRNA or ncRNA for the experiment.,
isolerend RNA is een vervelend proces in vergelijking met DNA-isolatie. RNA kan gemakkelijk afbraak zijn. Ook is de kans op besmetting hoog in RNA-isolatie.
daarom moet extra voorzichtigheid worden betracht bij het isoleren van RNA en de deskundige hand die nodig is om dit te doen.
zuiver RNA met hoge opbrengst moet vereist zijn voor het rangschikken van RNA.
de zuiverheid en hoeveelheid van RNA worden gemeten met behulp van Nanodrop of qubit.
Note: for isolating mRNA from the total RNA pool, one additional step is required, using the oligo dT specific column in the purification or final step of elution, total mRNA can be isolated from the rest of RNAs.
nu is ons RNA-monster klaar voor de volgende stap.,
Reverse transcriptase PCR:
een andere innovatieve methode voor het rangschikken van RNA is reverse transcriptase PCR, waarbij het RNA wordt getranscribeerd in DNA.
gebruikmakend van een speciaal type polymerase dat bekend staat als DNA reverse transcriptase, wordt de cDNA gesynthetiseerd uit het mRNA.
leer meer over RT PCR hier: Reverse transcriptase PCR.
cDNA-synthese van de tweede streng:
na de uit het mRNA gesynthetiseerde cDNA is de DNA-synthese van de tweede streng vereist. Voor dat, wordt PCR uitgevoerd gebruikend de normale polymerase van Taqdna in conventionele PCR.,
de Polymerase voegt dNTPs toe aan de groeiende DNA-streng met behulp van de primerset.
Bibliotheekvoorbereiding:
de eerste stap in de bibliotheekvoorbereiding of NGS-bibliotheekvoorbereiding begint met de fragmentaties.
met behulp van het speciale type restrictie-endonucleases is de hele reeks DS-cDNA gefragmenteerd voor de NGS.
opmerking:
de bibliotheekvoorbereiding varieert van platform tot platform omdat sommige fragmenten mRNA bevatten voordat reverse transcriptase wordt uitgevoerd, terwijl anderen het later na de voorbereiding van cDNA uitvoeren.,
in de laatste stap van de bibliotheekvoorbereiding worden de uiteinden verbonden met de adaptersequenties en versterkt voor het repareren van de uiteinden. dA-tailing is optioneel in het geval van mRNA-bibliotheek.
Library purification:
de gehele library wordt gezuiverd met behulp van de gebruiksklare DNA-zuiveringskit.
in de laatste stap is het zeer belangrijk om de hele fragmentbibliotheek te zuiveren, omdat de concentratie van de bibliotheek wordt beoordeeld met behulp van de kwantitatieve PCR of bioanalyzer.,
opmerking:
voor een beginner denk ik dat bibliotheekvoorbereiding en DNA-fragmentatie erg moeilijk te begrijpen is, dus we denken dat we een heel artikel moeten schrijven over genomische DNA-fragmentatie, bibliotheekvoorbereiding en het belang ervan in NGS.
hoe dan ook laten we verder gaan,
In de volgende stap wordt het monster van gefragmenteerd DNA verzonden voor sequencing.
DNA-sequencing:
nu wordt het monster gesequenced in de high throughput NGS-machine die de sequentie leest en ook het nucleïnezuur kwantificeert.,
de chemie achter het sequencen van de cDNA is afhankelijk van welke platforms we gebruiken, hoewel de veelgebruikte methode het gebruik van fluorescentiechemie is.
in de sequencer worden afzonderlijke fragmenten afzonderlijk “gelezen” en gesequenced. De definitieve gegevens worden naar het bioinformatielab verzonden voor post-sequencing analyse.,
Different types of RNA and its function:
| Abbreviation | RNA types | Function |
| mRNA | Messenger RNA | Codes for protein |
| tRNA | Transfer RNA | Transfer amino acid to the site of translation., |
| rRNA | Ribosomal RNA | Catalyse the translation reaction |
| miRNA | microRNA | Gene regulation |
| siRNA | Smaller interfering RNA | Gene regulation and maintaining gene expression. |
| LncRNA | Long non-coding RNA | Transcriptional regulation and epigenetic regulations., |
| snRNA | Small nuclear RNA | Helps in mRNA splicing and related functions |
| snoRNA | Small nucleolar RNA | Helps in RNA nucleotide modification |
| piRNA | Piwi-intercalating RNA | Function in defence against transposon; transposon defence system. |
| scaRNA | Small Cajal body-specific RNA | Also helps in nucleotide modifications (a type of snoRNA)., |
| shRNA | klein haarspeld RNA | synthetisch RNA-molecuul helpt bij genregulatie en controle van genexpressie. |
Transcriptome data analysis:
een van de vervelende taken, zoals we al besproken in het vorige artikel is de transcriptome data analyse en interpretatie van de resultaten. NGS-gegevens zijn enorm en complexer.,
eerlijk gezegd, het onderwijzen van data-analyse van transcriptomica is niet mogelijk, men zou hands-on oefening moeten nemen om te leren, toch zal ik proberen om je te leren wat de volgende stap is in dit proces.
verschillende fragmenten worden gesequenced in de machine en gegevens worden verzameld. In de volgende stap, op basis van het flankerende gebied van de fragmenten, worden de zogenaamde “contings” ingericht voor het verkrijgen van splice varianten.
In de volgende stap wordt het transcriptoom vergeleken met de referentiesequentie of kan de novo worden samengesteld.,
een kort overzicht van het gehele proces van RNA-seq.
sequencing van het gehele transcriptoom:
het gehele transcriptoom van een cel of weefsel-alle RNAs (mRNA, tRNA, rRNA, sncRNA, microRNA en siRNA) worden gesequenced en gekwantificeerd. Met andere woorden, we kunnen zeggen, zowel roman, evenals bekende transcripten, kunnen worden gesequenced.
hiervoor wordt de volledige set RNA uit het weefselmonster geëxtraheerd.,
Target RNA sequencing:
een genspecifieke cluster van genspecifieke, pathway-specifieke of ziektegerelateerde transcriptomen wordt gesequenced in de target-specifieke RNA sequencing.
het rangschikken van Doelrna is betaalbaarder en nauwkeuriger dan het gehele transcriptoom rangschikken. Bovendien wordt minder hoeveelheid van de steekproef van RNA vereist voor het doen van het experiment.
kleine RNA-sequencing:
een van de meest opkomende technieken in RNA-sequencing is het bestuderen van het kleinere niet-coderende RNA van een cel omdat deze geassocieerd zijn met zoveel functies in een genoom.,
kleinere RNA-moleculen zoals miRNA, siRNA en piRNA kunnen worden gekwantificeerd en gesequenced door de op NGS gebaseerde RNA-sequentiemethode voor diverse toepassingen.
mRNA-sequencing:
sequencing het volledige mRNA-transcript met behulp van poly (A) staartselectie gebruikt voor genexpressiestudies. Het gebruiken van mRNA het rangschikken bekende evenals nieuwe transcript wijziging kan worden ontdekt.
voordelen van RNA-sequentiebepaling:
een van de belangrijkste voordelen van RNA-sequentiebepaling is dat er geen voorafgaande sequentiegegevens nodig zijn., Aangezien het gehele proces niet op de op sonde-gebaseerde chemie wordt gebaseerd, is voorafgaande opeenvolgingsinformatie voor het ontwerpen van de sonde hier niet vereist.
nauwkeuriger en gevoeliger onderzoek naar genexpressie kan worden uitgevoerd.
breder dynamisch bereik.
leg zowel bekende als nieuwe wijzigingen van het transcript vast, zelfs als er geen sequentiegegevens beschikbaar zijn.
hoewel er geen referentiesequentie-informatie beschikbaar is, kan RNA-sequencing voor elke soort worden toegepast.
gerelateerd: Synthetische Genoommethoden, toepassingen en uitdagingen.,
conclusie:
concluderend kunnen we zeggen dat de RNA seq-methode geavanceerder en nauwkeuriger is dan de microarray. Ook, de veranderingen van novo kunnen ook worden ontdekt gebruikend het.